线粒体自噬的调控分子在不同病生理过程中的作用机制研究进展

陈红光，谢克亮，于泳浩

细胞自噬是一种自我降解的过程，对平衡能量来源和应对营养压力是非常重要的。自噬通过再利用或降解错误折叠或聚集蛋白、清除受损细胞器以及细胞内病原体等对细胞维持自身稳态起到了重要的作用[1]，因此，自噬通常被认为是一种生存机制，尽管自噬在非选择性的或选择性清除特定细胞器，核糖体和蛋白质聚集体等方面的机制尚未完全解决。除了消除细胞内聚集体和受损细胞器之外，自噬还促进细胞衰老和细胞表面抗原呈递，防止基因组不稳定并防止坏死，同时也在多种疾病中发挥关键作用[2]。而线粒体自噬是一种选择性自噬，通过清除受损和/或功能异常的线粒体，对线粒体的进行质量控制，维持线粒体网络的正常功能，为细胞提供稳定的能量供应[3]。近年来的研究发现，线粒体自噬在红血球分化、神经退行性病变、炎症和凋亡、缺血再灌注损伤和代谢相关疾病等多种生命过程中起到了一定的作用[4]。本文就线粒体自噬的研究进展做一个简要的介绍。

1 线粒体自噬

“自噬（autophagy）”一词源于希腊语意思是“自己吃自己（eating of self）”，最初是由Christian de Duve在40年前提出的，主要基于用胰高血糖素灌注的大鼠肝脏时，观察到线粒体和其他细胞内结构在溶酶体内降解[5]，在当时人们并不理解这种现象，近年来，由于对我们对各种分子的理解以及对来自众多实验室的这一过程的生理意义的重视，科学界重新认识了自噬，并且通过分子生物学在酵母中描述了自噬是如何被调节和执行的具体机制。自噬始于一种隔离膜结构，也称为吞噬泡，可能来源于由内质网和/或转运高尔基体和内涵体所形成的双层脂质膜，这种吞噬泡扩展吞噬细胞内的物质，如蛋白质聚集体，细胞器和核糖体，从而将要清除隔离在双层膜自噬体中，自噬体通过与溶酶体融合而成熟，促使溶酶体酸性蛋白酶降解自噬体内容物。溶酶体通透酶和转运蛋白将氨基酸和其他降解副产物输出回细胞质，重新用于构建大分子和新陈代谢。因此，自噬可以被认为是一种细胞“回收工厂”，它通过ATP产生促进能量效率，并通过清除非功能性蛋白质和细胞器来维持细胞稳定[2]。而对于选择性自噬了解最多的是线粒体自噬，其介导选择性清除受损线粒体。通过早期电子显微镜研究首次在哺乳动物细胞中观察到线粒体自噬，其在用胰高血糖素刺激肝细胞分解代谢后在溶酶体中鉴定增加的线粒体。Lemasters和他的同事[6]利用这个模型以及饥饿和光损伤引起的自噬，首次使用线粒体自噬这个术语来描述线粒体吞噬到被自噬体标记MAP1轻链3（LC3；酵母Atg8的同源物）包被的囊泡中，这一过程发生极快，可能在5分钟内发生。LC3（和Atg8）是一种泛素样蛋白质，在自噬体生物合成过程中与磷脂酰乙醇胺共价连接，从而使其能够整合到自噬囊泡膜并参与货物招募。另一项研究发现，在用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂培养以防止细胞溶解的神经元中，细胞凋亡诱导后通过线粒体自噬完全去除线粒体[7]。由于线粒体外膜透化发生在细胞凋亡期间胱天蛋白酶活化的上游，这些结果表明线粒体损伤可诱导线粒体自噬。这些早期研究表明，线粒体自噬调节线粒体数量以符合代谢需求，也可能是一种去除受损线粒体的质量控制形式[8]。在酵母和哺乳动物细胞中，线粒体自噬先于线粒体分裂[9]，将细长的线粒体分割成可管理的大小以进行包封，并通过线粒体自噬选择性清除受损线粒体以进行质量控制， 除了质量控制之外，线粒体自噬已被证明是稳定状态线粒体更新所必需的[10]，通过调节线粒体数量以改变代谢需要[11]。

2 线粒体自噬的重要调控分子

在哺乳动物线粒体自噬过程中中，有多种不同的线粒体自噬效应分子，包括线粒体自噬受体NIX/BNIP3和FUDNC1以及PINK1/Parkin途径，这三种通路已被确定参与线粒体的选择性清除。 自噬受体的一个共同特征是它们具有与LC3相互作用的LC3结合位点，从而促进线粒体被包裹进入到自噬囊泡中，从而发生线粒体自噬。

2.1 PINK1/Parkin介导的线粒体自噬 PINK1和Parkin突变已被认为是隐性家族性帕金森病的最常见原因[12]。PINK1是一种核编码的线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶[13]，Parkin是一种胞质E3泛素化连接酶[14]。遗传研究表明，PINK1和Parkin在同一途径中起作用，并且PINK1在Parkin上游起作用[15]。过去几年的大量工作极大地促进了PINK1和Parkin协同作用介导哺乳动物细胞线粒体自噬的分子机制。

PINK1作为线粒体应激感应器，其作用依赖于线粒体膜电位。在健康线粒体中，PINK1被导入线粒体，然后在线粒体内膜迅速发生降解。然而，当线粒体膜电位降低时，PINK1稳定结合于外线粒体膜，募集Parkin至受损线粒体，启动线粒体自噬[15]。最近，有关PINK1-Parkin相互作用和Parkin激活的更多细节已经被揭示。发现PINK1在线粒体去极化后激活并在多个位点发生磷酸化，包括Thr257，其使得PINK1在Ser65上磷酸化Parkin并导致Parkin的E3连接酶活性的激活[16]。据研究推测，在Parkin招募到线粒体并随后被激活后，它泛素化不同的线粒体外膜蛋白，这可能通过与接头蛋白（如p62和NRB1）相互作用介导线粒体随后隔离到自噬囊泡中。迄今为止，研究人员已经确定了Parkin的一些潜在底物，如mitofusins（Mfn1/2）[17]，Drp1[18]和PARIS（ZNF746）[19]，这些更加证明了Parkin在线粒体动力学，线粒体运输和调控线粒体生物发生等方面发挥了广泛作用。此外，研究表明p62是与Parkin一起募集至受损线粒体的[20]，通过其UBA（泛素化结合位点）和LIR（LC3结合序列）结构域将受损线粒体与自噬囊泡结合，然后转移至自噬溶酶体进行降解。

2.2 NIX/BINP3通路 BCL2和腺病毒E1B 19-kDa-相互作用蛋白3（BNIP3）和BNIP3样（BNIP3L，也称为NIX）线粒体定位蛋白，其与BH3-only家族有关。除了它们在细胞凋亡中的作用之外，发现BNIP3和NIX通过其LIR序列与LC3家族蛋白相互作用，从而介导线粒体的清除[21-22]。使用NIX敲除型小鼠的研究显示NIX参与网织细胞成熟过程[23]。线粒体的Nix依赖性清除与凋亡途径不同，因为它不需要其他Bcl2蛋白，如Bak，Bax，Bcl-xl，Bim或Puma[23]。那么Nix是如何参与线粒体自噬？ 关于网织红细胞成熟的研究表明，在诱导阶段不需要Nix， 相反，在晚期Nix需要将线粒体携带进入到自噬小体中，Nix含有称为LIR（LC3-相互作用区域）的保守LC3结合序列，因此可以将线粒体靶向输送至自噬小体[24]。Nix的功能可能不限于红细胞成熟，Nix也可能参与去极化诱导的线粒体自噬，因为CCCP处理HeLa细胞可以增强细胞中的Nix和LC3相互作用[21]，与Nix在红细胞成熟过程中作用不同的是，用解偶联剂FCCP处理网织红细胞可以在Nix不存在的情况下的诱导线粒体自噬的发生[25]，因此，我们Nix在去极化诱导的线粒体自噬中至多可能是具有促进作用但并非是完全依赖性的。 Nix和另一种BH3-only蛋白质Bnip3也参与缺氧诱导的哺乳动物成纤维细胞[24]和缺血再灌注的小鼠大脑神经元细胞[26]的线粒体自噬。在缺氧期间清除线粒体对于减少ROS产生和维持氧稳态是重要的。低氧条件下低氧诱导因子的激活诱导Nix和Bnip3的表达，其在高水平表达时可以破坏Bcl2和Beclin1之间的相互作用。而Beclin 1一旦释放，可诱导ATG5依赖性自噬的发生[27]。现在认为，NIX/ BNIP3的上调可能是促进它们在线粒体自噬中的活性的关键事件，但是其具体的作用机制还未明确[23]。

2.3 FUNDC1介导的线粒体自噬 最近，科研工作者已将FUN14结构域蛋白1（FUNDC1）鉴定为一种新的线粒体自噬受体[28]。FUNDC1是一种外线粒体膜蛋白，含有三个跨膜结构域，其N端和C端分别暴露于胞质溶胶和膜间隙[28]。 在FUNDC1沉默的细胞中，与对照细胞相比，缺氧处理不能诱导线粒体自噬，并且通过重新表达野生型FUNDC1可以挽救线粒体自噬[28]。 这些结果表明FUNDC1在缺氧诱导的线粒体自噬过程中作为特定的线粒体自噬受体起作用。研究发现FUNDC1在它的胞质溶胶暴露的N-末端含有LIR序列，并且LIR基序对于FUNDC1-LC3相互作用是必需的[28]。 FUNDC1的LIR突变显着地使线粒体自噬受损，其LIR的缺失将阻断线粒体自噬的诱导。 这些发现表明FUNDC1-LC3相互作用是FUNDC1诱导的线粒体自噬所必需的。

FUNDC1介导的线粒体自噬的调控机制最近已被揭示，研究发现FUNDC1的多位点磷酸化在调节FUNDC1-LC3相互作用中起关键作用[29]。在常氧环境下FUNDC1发生磷酸化。 Src和CK2分别是负责FUNDC1在Tyr18和Ser13处磷酸化的激酶，并且这两个位点的磷酸化可以抑制FUNDC1与LC3的相互作用。 在缺氧或线粒体解偶联剂处理期间，Src和CK2失活，并且线粒体磷酸酶PGAM5与FUNDC1的Ser30相互作用发生去磷酸化，这种修饰增强了FUNDC1-LC3相互作用，从而诱导线粒体被自噬囊泡包裹发生线粒体自噬[28,30]。有研究发现，敲除FUNDC1基因将会损害血小板中线粒体的质量，并且增加线粒体的数量，使得血小板对缺氧刺激不敏感[31]。

3 线粒体自噬在疾病中的作用

在这一部分，我们将主要介绍线粒体自噬在不同病理过程中的作用。

3.1 线粒体自噬神经退行性疾病的作用 帕金森病（PD）已经被证实与线粒体功能障碍密切相关[32]，特别是PD患者的黑质中复合体I活性降低和线粒体DNA的积累与PD的发生有特异性[33]。 PARK6和PARK2突变分别编码PINK1和PARKIN蛋白，导致常染色体隐性PD，PD患者黑质中中受损线粒体的清除缺陷可能是该疾病的重要病因。Sterky等人在Mito Park小鼠中使用线粒体荧光标记（mito-YFP）研究了体内多巴胺神经元的线粒体动力学。由于线粒体转录因子A（TFAM）的特异性敲除，Mito Park小鼠显示PD特征，作者使用这些小鼠，发现呼吸链缺陷导致线粒体网络碎片化，并形成来自线粒体的大细胞质体。线粒体的顺行轴突运输也在呼吸链缺陷的小鼠神经元中受损，导致线粒体向轴突末端的供应减少。有趣的是，Sterky等人发现功能失调的线粒体并未在体内招募PARKIN，并且PARKIN的缺失也并未影响功能受损线粒体的清除和神经退化表型[34]。这些数据表明线粒体功能障碍不足以招募PARKIN并诱导线粒体自噬。然而，最近的一项研究表明，在对局部损伤的反应中，在远端轴突中出现了Parkin依赖的线粒体自噬[35]。近年来，许多研究讨论了线粒体自噬和PARKIN介导的线粒体自噬在神经退行性疾病如肌萎缩侧索硬化[36]，亨廷顿病[37]和阿尔茨海默病[38]中的意义。比如，最近的研究结果表明线粒体自噬在唐氏综合征（DS）中可能存在一定意义，唐氏综合征患者的大脑表现出ROS平衡异常，并且ROS积聚增加，这表明线粒体受损[39]。但需要进一步的研究来阐明线粒体自噬在这些疾病中的确切作用。

3.2 线粒体自噬在糖尿病中的作用 激素可以促进或抑制线粒体的降解。例如，甲状腺激素可以调控线粒体的代谢[40]，而禁食和胰高血糖素通过线粒体自噬和肝细胞中的非选择性自噬促进线粒体降解[41-42]。由于这些激素控制体内能量稳态，并在各种代谢紊乱中发挥重要作用，因此人们对线粒体自噬在肥胖症，1型糖尿病和2型糖尿病中的作用越来越感兴趣。先前已报道肿瘤蛋白p53诱导型核蛋白1和2（TP53INP1和TP53INP2）是2型糖尿病的易感基因。这两种蛋白质含有LIR结构域，因此可能在自噬中发挥作用[43]。缺乏TP53INP1的小鼠显示易于发生氧化还原驱动的肥胖和胰岛素抵抗。TP53INP1-KO小鼠存在线粒体自噬缺陷，导致受损线粒体增加[44]。线粒体自噬缺陷导致氧耗率下降和线粒体ROS产生增加。并且TP53INP1也存在于线粒体中，与PINK1和PARKIN相互作用，但与NIX和BNIP3不相关[44]。像TP53INP1一样，TP53INP2也可以调节自噬并且是自噬体形成和加工所必需的[45]，TP53INP2表达在来自2型糖尿病患者的肌肉组织和糖尿病小鼠模型中被抑制[46]。这种蛋白质在线粒体自噬中的作用尚待确定。另外在基础状态下，胰腺β细胞功能需要自噬，ATG7敲除小鼠中自噬机制的遗传失活导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少。同时在基础状态下敲除PINK1，对于胰腺外分泌腺的线粒体自噬小体的数量没有影响，但是可以明显增加内分泌腺线粒体自噬小体的数量[16]，说明PINK1对于胰腺外分泌腺的线粒体功能的稳定具有一定作用。

3.3 线粒体自噬在细胞死亡、炎症和缺血再灌注损伤的作用 关于自噬是促进死亡还是抑制死亡的问题，是一直存在争议的。凋亡（self-killing）被描述为细胞的程序性死亡，也被成为I型细胞死亡；而自噬（self-eating）在某些情况下，是一种可以避免细胞死亡（并可抑制细胞凋亡）的应激适应，而在其他环境中，自噬成为了细胞死亡的替代途径， 被称为自噬性细胞死亡（或II型细胞死亡），所以自噬和细胞死亡之间的关系是复杂的[47]。当线粒体功能受损时，线粒体会释放出凋亡相关信号，激活线粒体凋亡通路，引起细胞死亡，而同时功能受损的线粒体会被线粒体自噬相关蛋白识别以清除受损线粒体，减少凋亡信号的释放，起到保护细胞的作用。有相关研究表明，用IL-1b处理人软骨细胞以模拟骨关节炎，SiRNA干扰Parkin表达抑制线粒体自噬会使得细胞内ROS含量升高，加重细胞凋亡[48]，因此认为线粒体自噬对细胞死亡是有保护作用的。但是过度的自噬将会引起各种溶酶体酶从自噬溶酶体释放出来，从而使得细胞发生凋亡和/或坏死[49]。对于细胞炎症，相关研究表明，缺失自噬相关蛋白Atg16L1可以增强内毒素诱导的IL-1b的产生[50]，而在脓毒症晚期，有学者认为自噬是被耗竭的[51]，也有研究发现在巨噬细胞中通过线粒体自噬清除受损线粒体可以抑制炎症小体的活化，减轻炎症反应[20]。而线粒体自噬对缺血再灌注损伤中也起到了保护性作用，研究发现肾缺血/再灌注诱导的线粒体自噬通过Drp1依赖性途径可以防止肾功能障碍[52]，而BINP3L/NIX介导的线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中具有保护作用，且不依赖PARK2[26]。

4 小结

通过线粒体自噬清除线粒体，调节线粒体的数量以满足能量代谢的需要，同时清除受损线粒体以对线粒体网络维持质量控制。线粒体自噬通过几个特殊的步骤，将多余的或功能受损的线粒体靶向输送到自噬小体。在酵母菌中，通过Atg32向自噬体募集多余和/或受损的线粒体；在哺乳动物中，NIX介导红细胞成熟过程中线粒体的发育性去除，并且parkin/PINK1和FUNDC1可调节许多细胞类型中受损线粒体的选择性自噬。但是现在很难对线粒体自噬进行精确而定量的检测，所以就无法准确地评估线粒体自噬发生的多少快慢，这是我们所面临的一个问题。另外线粒体做为细胞的能量工厂，其生物能量学主要包括ΔΨ，ATP产生，氧气消耗和ROS等，其中任意一个环节出现问题，均会引起线粒体功能障碍，而线粒体自噬通过控制线粒体的数量和效率来调节线粒体能量代谢。线粒体的数量和效率也受线粒体生物合成的控制，但线粒体生物合成和线粒体自噬之间的协调仍然是一个悬而未决的问题。围绕线粒体生物能量学、线粒体动力学和周转效率的协调的这些问题将有望为线粒体能量代谢和线粒体自噬的研究提供未来的方向。