耐药性癫痫与P糖蛋白的研究进展

癫痫是以脑部神经元异常放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征的一种疾病。全球大约有7 000万人罹患癫痫，我国大约有900万癫痫病人[1-2]。目前，我国临床上有近30种抗癫痫西药，但临床上约有50%新诊断的病人首次接受药物治疗后，癫痫不能够得到控制；另有约30%的病人为耐药性癫痫[3]。2010年国际抗癫痫联盟对耐药性癫痫的定义达成共识，一是抗癫痫药物治疗的结局分类：临床无发作、治疗失败及不确定； 二是在治疗失败的基础上提出了耐药性癫痫的核心定义：两种正确选择、可耐受的抗癫痫药，经足够疗程及剂量治疗(单药或联合用药)后仍未能控制发作的癫痫[4]。针对癫痫耐药性发病机制目前存在6种假说：多药转运体假说、基因突变假说、药物靶点假说、药代动力学假说、神经网络假说以及疾病自身严重性假说[5]。其中多药转运体假说于1995年由美国学者Tishler提出，认为多药转运蛋白P糖蛋白(P-gp)参与了抗癫痫药物的跨膜转运，能够通过水解三磷酸腺苷(ATP)获取能量，主动将抗癫痫药物逆浓度梯度外排出脑组织，降低脑组织中药物浓度，而引起癫痫多药耐药[6]。多药转运体假说的提出引起了学术界的广泛关注与研究。理论上P-gp介导耐药性癫痫假说的成立应当满足以下3个前提：第一，癫痫耐药病人血脑屏障中P-gp高表达；第二，抗癫痫药物为P-gp作用底物；第三，癫痫耐药病人脑组织中抗癫痫药物浓度较药物敏感性癫痫病人低。本研究就这3个方面进行综述，为P-gp介导耐药性癫痫的假说的成立提供可能的科学证据。

1 P-gp概述

P-gp 为ATP 结合盒超家族蛋白(ATP-binding cassette，ABC)成员，分子量约为170 KD。1976年Juliano 和 Ling在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现P-gp。人体中P-gp主要由位于人类第7号染色体 q21.1的多药耐药基因1和2(multi-drug resistance gene，MDR)编码[7]，而啮齿类动物则有mdr1a、mdr1b和mdr2 3个基因可编码 P-gp[8]。其中人体中的MDR1与啮齿类动物的mdr1a、mdr1b功能相同，编码P-gp参与多药耐药。而MDR2与mdr2则主要表达胆小管胆碱转运蛋白[8-9]。P-gp主要表达于肠道、肝脏、肾脏、血脑屏障以及血胎盘屏障等各类屏障与代谢器官中[10-11]。在正常的脑组织中，P-gp主要表达于血脑屏障脑血管内皮细胞与血脑脊液屏障脉络丛上皮细胞中[12]。生理状态下 P-gp 起到阻止外源性毒素入侵，排出内源性有毒物质，维持内环境稳定的作用，是人体中重要的防御机制[13-14]。目前已发现数百种P-gp的作用底物，这些底物广泛分布于天然药物、化学药物、类固醇、荧光染料、环肽以及离子载体中；主要是疏水性和两亲性，多为杂环化合物。一般而言，脂溶性越强的药物越容易进入脑组织中。临床上大部分抗癫痫药物都为脂溶性的，但是仍有1/3的癫痫病人对抗癫痫药物不耐受[3]。其中可能的原因是癫痫病人血脑屏障中过表达的P-gp将脂溶性的抗癫痫药物逆浓度梯度排出脑外，降低了脑组织中癫痫药物的浓度[6]。

2 耐药性癫痫P-gp高表达

2.1 动物实验 电刺激建立癫痫持续状态后颞叶癫痫模型因较易出现自发性癫痫发作而被学者们广泛使用。在该模型建立急性与慢性期皆存在P-gp的高表达。建立模型7 d后发现，大鼠脑组织中出现mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表达，同时慢性期大鼠腹侧颞叶神经胶质细胞、内皮细胞、颞叶海马以及海马旁回中也存在不可逆的mdr1b mRNA与 P-gp的过表达，并且其表达量与癫痫发作次数呈正相关[15-16]。此外，在氯化锂-匹罗卡品点燃的癫痫持续状态模型中，大鼠脑组织中可检测到P-gp的高表达[17-18]。此外，腹腔注射亚剂量戊四氮反复点燃的癫痫大鼠模型海马与皮层中亦能检测到高表达的mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp[19-21]。Lazarowski等[22]反复给wistar大鼠腹腔注射3-巯基丙酸诱发癫痫后，大鼠血脑屏障中P-gp的表达呈进行性增加；另外，给3-巯基丙酸诱发的癫痫模型大鼠腹腔注射苯妥英钠后，与正常大鼠相比其海马中苯妥英钠浓度明显下降，并且P-gp抑制剂尼莫地平能够扭转这种下降。最近，3-巯基丙酸诱发的癫痫模型被选定为抗癫痫药物临床前实验的新模型。经3-巯基丙酸持续诱发23次癫痫后，100%的动物对苯妥英钠耐药，80%的动物对苯巴比妥耐药[23]。给癫痫小鼠模型腹腔注射苯妥英钠(30 mg/kg)或卡马西平(15 mg/kg)，每天2次，干预7 d后，小鼠脑微血管内皮细胞P-gp显著升高[24-25]。每天给大鼠腹腔注射苯巴比妥(30 mg/kg)或苯妥英钠(30 mg/kg，首剂75 mg/kg)，干预11 d后，各脑区(额叶皮层、顶叶皮层、杏仁核、海马、齿状回、梨状皮质，黑质网状部和小脑)均未出现P-gp的高表达[26]。相反，马桑内酯引起的癫痫持续状态大鼠模型每天经125 mg/kg卡马西平或187.5 mg/kg丙戊酸钠灌胃后，大鼠星形胶质细胞、内皮细胞、海马、颞叶大脑、额叶大脑以及顶叶大脑中均出现P-gp高表达；而给予100 mg/kg托吡酯或125 mg/kg拉莫三嗪干预后并未影响P-gp的表达[27-29]。动物实验证实，反复进行化学诱导、电刺激以及长时间使用一些抗癫痫药物能够诱导癫痫大鼠、小鼠模型脑组织中mdr1a mRNA、mdr1b mRNA以及P-gp的高表达。

2.2 临床实验 1995年，美国学者Thishller 对19例难治性局灶性癫痫病人脑组织进行检测发现，有11例病人癫痫病灶组织中MDR1 mRNA表达水平比自身正常脑组织高10倍；14例病人脑血管内皮细胞中出现P-gp的过表达[6]。Liu等[30]使用免疫荧光技术对癫痫致病灶、硬化海马以及正常的脑区中P-gp的表达进行半定量分析，发现硬化海马中P-gp阳性颗粒明显增多。Lazarowski等[31]对1例对苯妥英钠、苯巴比妥以及劳拉西泮耐药的癫痫病人手术切除的致痫灶进行检测，发现了P-gp的高表达。在难治性癫痫病人颞叶内皮细胞中亦能检测到过表达的P-gp。Rambeck与他的同事使用圆形微透析探头对难治性癫痫切除术中的病人癫痫灶组织细胞外液、脑脊液以及血浆中的抗癫痫药物浓度进行了检测，发现癫痫灶组织中的抗癫痫药物浓度明显比脑脊液中低。这也是首例报道癫痫致病灶抗癫痫浓度的降低关系着耐药性癫痫的产生[32]。Summers等[33]对1例难治性癫痫病人常规用药中添加了P-gp抑制剂维拉帕米后，该病人癫痫控制情况以及生活质量明显改善。临床实验表明，耐药性癫痫病人癫痫病灶与正常脑组织相比，MDR1与P-gp存在高表达，并且癫痫灶组织中的抗癫痫药物浓度明显降低；这可能提示某些抗癫痫药物为P-gp的作用底物。

以上动物与临床实验结果可初步推测出以下两点：第一，癫痫的反复发作以及长时间服用抗癫痫药物均能够引起P-gp高表达；第二，一些耐药性癫痫病人脑组织中确实存在高表达的P-gp。然而既往临床实验皆缺乏健康对照组和药物耐受性对照组，相关结论需要进一步证实。此外，在P-gp高表达的前提条件成立的情况下，高表达的P-gp能够作用于抗癫痫药物，对于P-gp介导耐药性癫痫假说的成立则尤为重要。

3 P-gp与抗癫痫药物

P-gp能够主动转运疏水性和两亲性化合物，而大部分抗癫痫过程依靠平面亲脂性分子，所以理论上很多种抗癫痫药物都应该为P-gp的底物。第1个关于P-gp转运抗癫痫药物的实验是由Tishler完成的。他发现与正常的神经外胚层细胞相比，MDR1高表达的神经外胚层细胞中苯妥英钠含量显著降低[6]。这一实验结果在癫痫持续状态引起的P-gp高表达的大鼠和mdr1a/b基因敲除的小鼠体内得到证实[24，34-35]。在大鼠脑组织微量透析实验中，通过微透析探针给予P-gp抑制剂维拉帕米的干预后，显著地增加了大脑皮层细胞外液中苯巴比妥、拉莫三嗪、非尔氨酯以及奥卡西平的含量。相反，在mdr1a基因敲除的小鼠实验研究中，仅发现P-gp能够作用于托吡酯，而对苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平、氨己烯酸、拉莫三嗪以及加巴喷丁无作用[36]。

关于P-gp作用于卡马西平的实验研究得到了不同的实验结论[37]。据Mdr1a/b基因敲除的小鼠体内实验和体外Caco-2以及人体淋巴细胞罗丹明123集聚实验结果，Owen 等[38]认为卡马西平不是P-gp的作用底物。而在大鼠脑组织微量透析实验中发现，P-gp抑制剂维拉帕米干预后显著地增加了大脑皮层细胞外液中卡马西平的浓度。另1项使用mdr1a/b基因敲除的小鼠实验研究亦得到相似的结论[39]。在单层细胞外排实验中，发现转染了人和小鼠编码P-gp cDNAs的猪与狗肾脏细胞并不能够转运丙戊酸钠[40]。Baltes等[41]使用相同的细胞模型进行了双向传输实验，表明苯妥英钠和拉莫三嗪只能够被小鼠编码的P-gp转运。有研究指出由于大部分抗癫痫的药物为高渗透性，抗癫痫药物的主动扩散作用可影响P-gp作用于抗癫痫药物的结果，传统的双向传输实验并不是研究P-gp与抗癫痫药物相互关系的理想模型。因此，他们使用了一种改良的实验方法，即浓度平衡运输法。浓度平衡运输法是指实验开始即在细胞两侧加上等浓度的抗癫痫药物，以消除抗癫痫药物主动扩散作用对P-gp功能的影响。浓度平衡运输法检测出苯妥英钠、苯巴比妥、拉莫三嗪以及托吡酯均能够被人体编码的P-gp转运[42]。Zhang等[43]利用双向传输实验和浓度平衡运输法证实了以上结论，并且发现乙琥胺亦是P-gp的作用底物。Verbeek等[44-45]在大鼠体内使用PET示踪技术研究了苯妥英钠与P-gp相互关系，发现P-gp对苯妥英钠有微弱的转运作用；在同样的实验设计里，结果显示p-gp并不作用于苯巴比妥。目前有关P-gp与抗癫痫药物的临床实验尚缺乏。Marchi等[46]对11例术中的难治性癫痫病人利用液相与紫外技术检测了其脑组织与血浆中奥卡西平代谢产物10-OHCBZ的浓度；并且使用逆转录PCR技术检测了致痫灶组织中MDR1 mRNA的表达水平，研究发现脑组织与血浆中10-OHCBZ的浓度比值与致痫灶组织中MDR1 mRNA的表达水平呈负相关，随后进一步显示了P-gp抑制剂XR9576的干预能够促进细胞对10-OHCBZ的吸收。

关于P-gp与抗癫痫药物的相互关系，不同的模型可能得到不同的结果，甚至相反的结论。2012年，Zhang等[47]总结了拉莫三嗪、奥卡西平、卡马西平、苯巴比妥以及苯妥英钠是P-gp作用底物，且与P-gp的相互作用关系在体内外多项实验中获得证实。

4 小 结

针对癫痫耐药性发病机制存在多种假说，其中最受关注的为多药转运体假说。该假说认为，多药转运蛋白P-gp参与了抗癫痫药物的跨膜转运，能够通过水解ATP 获取能量将药物逆浓度梯度外排出脑组织，降低脑组织中抗癫痫药物的浓度，而引起癫痫多药耐药。为了论证该假说的成立，学者们进行了大量的临床与基础实验，主要的发现有：①癫痫耐药病人与耐药动物模型血脑屏障中存在P-gp高表达 ；②一些抗癫痫药物为P-gp作用底物，如拉莫三嗪、奥卡西平、卡马西平、苯巴比妥以及苯妥英钠等；③癫痫耐药病人脑组织中抗癫痫药物浓度较药物敏感性癫痫病人低。当然，有些实验设计亦存在不足之处。如临床实验缺乏正常脑组织的对照；Mdr1a/b基因敲除的动物中其他转运蛋白的代偿性表达而出现实验结果的不一致性；细胞模型评价标准的不统一等；这些因素皆影响着该假说的成立，相关实验应该更进一步的完善补充。有关耐药性癫痫与P糖蛋白的研究有利于发现新的治疗癫痫以及预防和扭转癫痫耐药性的方法，值得更深入的研究。