线粒体功能障碍与脑缺血的研究进展

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，包括诸多环节，如能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等的级联反应，这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。线粒体是一个结构和功能复杂而敏感的重要细胞器，是细胞的发电机，在能量代谢、电子传递链和氧化磷酸化中起着至关重要的作用，线粒体膜电位有助于维持线粒体内膜和外膜的质子梯度、高能磷酸盐(ATP)的产生。线粒体在细胞存活中具有这些基本和关键的作用，线粒体功能障碍导致细胞受损。线粒体功能障碍后膜电位丧失，从而影响ATP的产生，导致氧化应激损伤[1-3]，激活各种促凋亡和凋亡因子，进一步导致脂质、蛋白质和DNA的破坏。近年来，线粒体功能障碍已成为脑缺血治疗研究的热点。线粒体的功能障碍主要表现为线粒体通透性转换孔、氧化应激、细胞凋亡。现对线粒体功能障碍与线粒体自噬在脑缺血中的作用机制做一综述。

1 线粒体膜通透性转换孔

线粒体膜通透性变化在细胞凋亡或坏死中具有重要作用，线粒体膜通透性转换孔(mitochondria permeability transition pore，MPTP)可影响线粒体膜通透性变化。线粒体膜通透性是由位于线粒体内膜中的电压依赖性高电导通道介导的高度复杂的机制。脑缺血后一系列病理生理变化促进这个电压依赖性通道的开放，最终导致线粒体膜通透性的转变，即通透性转换孔(permeability transition pore，PTP)。脂质微环境的改变与Bcl-2的失活也在PTP之前[4]。脑缺血再灌注期间pH值增加，导致MPTP形成。MPTP的形成导致了水的流入增加，进而线粒体肿胀，线粒体膜功能障碍[5]。PTP是由位于线粒体内外膜及基质中的多种蛋白质组成的复合体，主要由位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)、位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道(VDAC)和位于基质的亲环蛋白D(cyclophilin D，Cyp D)组成，基质中的 Bcl-2 蛋白家族、己糖激酶、磷酸盐载体、外周苯并二嗪受体、肌酸激酶等对其进行调节。ANT 主要催化胞质中的 ADP 与线粒体中的 ATP进行交换。VDAC的生理功能为控制ATP、 ADP和其他一些代谢物质穿过线粒体外膜， Cyp D调节 PTP对Ca2 +的敏感性， 这些蛋白的构象改变导致PTP的开放[6]。

Bcl-2家族蛋白(Bax，Bid，Puma和BNIP3)也增加了线粒体内外膜的通透性，从而导致渗透性孔的形成[7]。缺血后发生的再灌注增强了Bcl-2家族蛋白的激活，并上调其他凋亡因子。Bcl-2蛋白通过与VDAC和其他促凋亡蛋白相互作用形成自身的蛋白渗透性孔。另外，氧化剂、无机磷酸盐和碱性pH的存在也有利于PTP的形成[7-8]。

MPTP破坏线粒体内膜的通透性屏障，从而引发氧化磷酸化的解偶联、渗透性肿胀和外膜破裂。线粒体蛋白的释放同时激活半胱天冬酶级联反应，并诱导核酸内切酶，最终导致不可逆的DNA损伤和神经元死亡。此外，线粒体群体中PTP形成的模式决定了死亡的坏死或凋亡模式。 线粒体肌酸激酶-1耗尽时导致凋亡神经元死亡，p53单独导致凋亡细胞死亡，而p53与Cyp D的相互作用导致坏死的神经元死亡[9-10]。

除此之外，线粒体转换孔形成导致线粒体外膜的机械性破坏，从而导致线粒体基质肿胀[11]。氧化磷酸化解偶联之前的基质肿胀引起细胞色素C(Cyt C)的释放。这反过来激活凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor， AIF)和内切酶G(endonuclease G，Endo G)，然后转移到细胞核并激活染色质浓缩和DNA片段化[12]。 Cyt C也触发IP3受体，从而增加胞质Ca2+和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。此外，PTP诱导线粒体的分裂/融合和线粒体自噬[13]。因此，线粒体膜通透性是严格调控的现象，是导致神经元死亡的主要原因。

2 线粒体与氧化应激

缺血再灌注导致大量自由基产生及细胞内钙超载，线粒体可作为亚细胞靶标而受到损害。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的生理病理过程，氧化应激损伤对线粒体功能的影响是导致细胞死亡的核心环节[14]。还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的氧化引起细胞内线粒体钙释放的增加，NADPH在线粒体抗性中起关键作用，因为它在清除自由基中起着至关重要的作用。由于超氧化物清除活性降低和超氧化物累积增加，NADPH的氧化也扩大了氧化应激[15]。除此之外，谷胱甘肽转移酶(GSH)减少，加强NADPH的氧化，由此导致线粒体死亡。线粒体无机磷(Pi)的氧化损伤通过生成烯醇产生三重态醛(也是活性氧)，从而导致形成MPTP。病理条件下氧自由基生成持续增加， 过高的ROS持续积累导致MPTP持续开放，促发线粒体凋亡通路。线粒体是唯一含有独立DNA的细胞器。与核DNA相比， mtDNA 缺乏组蛋白和DNA结合蛋白的保护，并与氧化磷酸化场所(线粒体内膜)相距甚近， 又直接暴露于氧化磷酸化过程中产生的高反应性氧中， 因此，极易受氧自由基的攻击[16]。

氧化应激和ROS是缺血性损伤的主要促成因素，因此，氧化损伤的作用在神经元疾病中日益受到重视。

3 线粒体自噬

线粒体自噬不同于传统自噬，是选择性去除受损线粒体的一种靶向自噬。线粒体自噬的发生机制与线粒体形态动力学有关，且受到线粒体自噬信号通路的调节。线粒体自噬与脑缺血再灌注损伤的病理生理过程有密切联系，一方面脑缺血再灌注的过程能诱导线粒体自噬的产生，另一方面线粒体自噬又对脑缺血再灌注损伤的转归有重要影响。几种特殊的蛋白质即Parkin(E3 泛素连接酶)，PINK1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)和FUNDC1(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)被认为可能参与了线粒体自噬的过程。

线粒体自噬在脑缺血中受到越来越多的关注，并且已经在体内模型和培养的神经元中得到证实。在脑缺血中，线粒体自噬可能主要由PINK1/Parkin途径介导。然而，线粒体自噬在缺血性脑损伤发展中的作用仍存在争议。研究表明，线粒体自噬是一把双刃剑，在实验性脑缺血后既可以起到保护作用，亦可起破坏作用[17-20]。大多数研究支持：线粒体自噬通过去除受损的线粒体和抑制细胞死亡信号级联来支持适应应激的神经元。这些研究表明线粒体自噬是脑缺血治疗的一个有前景的治疗靶点。在永久性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery embolism，MCAO)中，线粒体自噬在1 h之内被触发，以Drp1依赖的方式参与去除受损的线粒体和细胞存活[21]。 MCAO后再灌注期间也会激活线粒体自噬，并有助于抑制脑缺血后细胞凋亡。 雷帕霉素通过增强脑缺血后的线粒体自噬来改善线粒体功能[22]。 亚甲蓝在急性脑缺血中的神经保护作用也可以通过促进线粒体自噬和维持线粒体膜电位来证明，从而减少坏死[23]。线粒体自噬对脑缺血后肢体远端缺血也有神经保护作用[20]。脑缺血后线粒体自噬的破坏作用也有报道， 通过降低p-Drp1和Parkin抑制线粒体自噬介导了MCAO后大鼠肌肽的神经保护作用[17]，过度诱导线粒体自噬导致新生儿卒中的细胞死亡[18]。

线粒体自噬在脑缺血中的有害作用尚未得到充分强调， 需要进一步研究以了解线粒体自噬在脑缺血后是有益的还是有害的。 线粒体自噬的影响主要取决于它的严重程度， 虽然生理或轻度的线粒体自噬有利于神经元存活，但是强烈或过度的水平可能是致命的并且加剧缺血性脑损伤。

4 线粒体与细胞凋亡

细胞色素C从线粒体中释放，激活凋亡诱导因子(AIF)、procaspase-9和caspase-3，并通过形成凋亡体触发凋亡。尽管细胞色素C释放的机制尚不清楚，但可能有两种机制，例如由于基质肿胀引起的线粒体外膜机械损伤与促凋亡蛋白Bax向线粒体膜的转运[4]。因此，线粒体通透性转换(MPT)与促抗凋亡蛋白之间的复杂相互作用表明MPT是细胞凋亡的一个不可缺少的组成部分。

调查显示，氧化型细胞色素C能快速激活caspase-9。线粒体细胞色素氧化酶明显氧化外部细胞色素C。已经阐明了加速细胞色素c氧化导致细胞凋亡的几种机制。细胞色素C在神经元内的还原率较高。这也取决于细胞内谷胱甘肽的氧化还原状态。

细胞色素C还诱导肿瘤基因p53，其是细胞应激反应的关键调节剂。p53基因通过激活促凋亡基因和对死亡刺激反应的转录非依赖性机制触发细胞凋亡。最近的研究表明，p53蛋白可以通过与Bcl-2家族蛋白形成抑制性复合物来改变线粒体外膜的膜通透性，导致细胞色素C的释放[10]。然而，线粒体p53介导的神经细胞凋亡的途径仍不清楚，线粒体p53对细胞色素C释放和随后的神经元死亡的作用仍不明确。

5 结 语

线粒体功能障碍是脑缺血病理生理学的早期和初始事件[24]。在临床上药理学靶向线粒体仍然具有挑战性。新出现的研究结果表明，线粒体本身可以起到“帮助我”的作用，响应多种细胞外刺激，并募集相邻细胞以拯救受伤者细胞，去除受损的线粒体和补充健康的线粒体是治疗缺氧/缺血相关疾病的很有希望的治疗方法，特别是在中枢神经系统中线粒体在远端轴突突触和树突突起中丰富[25]。解决线粒体这些障碍将有助于为与线粒体功能障碍相关疾病研发新的治疗方法。