大花序桉外植体消毒及诱导试验

周小华，张 伟，黄志萍，张海忠，王炳南，汤建福，谢 恩

(1.福建生态工程职业技术学校，福建 福州 350008； 2.漳州市林业局，福建 漳州 363000；3.漳州长泰岩溪国有林场，福建 长泰 363900； 4.漳州平和天马国有林场，福建 平和 363700)

大花序桉(Eucalyptus.cloeziana)又名昆士兰桉、金皮楠、澳洲金皮楠，天然分布于澳大利亚，大乔木，树高可达45 m[1]，树干通直，材质好，是很好的家具、室内装饰、矿柱、坑木及建筑用材；大花序桉树种耐干旱瘠薄、抗病虫害能力强，生长迅速，尤其是后期生长优势非常明显，是极具培育价值的大径材树种。由于大花序桉引种的种源少，开花结实量也少，造成苗木紧缺，此外实生苗造林遗传分化明显，给造林管理带来很大的挑战和困难，因此制约了其大规模推广与发展[2]。组织培养是桉树种苗繁育的一种重要技术手段，即能规模化生产，又能够保持母本的优良特性。近几年，唐再生[3]、唐庆兰[4]、陈晓明等[5]都曾对大花序桉组织培养进行研究，通过诱导得到无菌苗，继而进行继代培养，生根培养试验，初步建立了“以芽繁芽”的组培快繁体系，但生根率不一，最高达86%[6]。目前，尚未见大花序桉组织培养苗产业化生产的报道，大花序桉组培苗产业化生产的瓶颈在于生根率偏低。本研究对大花序按组织培养快速繁殖进行深入研究，主要以大花序桉茎段芽诱导后的无菌苗为材料，研究其外植体消毒、诱导、继代增殖培养，以获得大量的组培苗，为生根培养打下基础。目的在于建立大花序桉组织培养快速繁殖体系，为工厂化育苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自漳州市引种的大花序桉优良单株，选择连续晴天2 d以上且枝条无露水时(一般在上午9∶00—10∶00左右)进行取样，剪取正处生长季节、当年生、幼嫩部分、无病虫害、芽体饱满、生长健壮的枝梢。保鲜带回实验室。

1.2 试验设计与方法

本研究在查阅大量相关文献的基础上，根据试验的目的和计划，着重探讨大花序桉茎段外植体消毒及其芽诱导组织培养技术，采用正交设计或完全组合设计安排试验，探讨外源激素的添加效果，筛选最有利的内外源激素的组合和比例，筛选出最优技术参数组合，从外源激素的协调上建立大花序桉最优组培快繁体系。

1.2.1 外植体消毒 先用清水和软毛刷洗净外植体表面附着物，后放入洗衣粉稀释液中逐个刷洗，再置于流水中彻底洗掉洗涤剂，将外植体修剪后放入无菌瓶中；随后转入超净工作台上，将所需茎段的叶柄部分剪去，剪成带有1～2个腋芽茎段，用无菌滤纸吸干茎段表面水分。选择2%次氯酸钠、75%食用酒精、0.1% HgCl2为消毒剂，根据外植体消毒程序设计若干个消毒方案进行灭菌(表1)。2～3种药剂处理间均用无菌水浸洗3～5次，用HgCl2消毒时可加入2～3滴吐温-80。药剂处理完后，用无菌水浸洗3～5次，直到清澈无泡沫为止。且每次无菌水浸洗时间不少于2 min。药剂处理与无菌水浸洗均在无菌培养瓶中密封振荡处理，以便无菌水与组织材料充分接触。

1.2.2 外植体诱导 全部接种工作均在经严格灭菌的超净工作台上进行。消毒后的茎段在无菌条件下接种诱导，诱导试验方案见表2。接种数量为每种配方33瓶，每个处理接种10～11瓶，每瓶接4～5块外植体，重复2～3次，若由于一些外界或人为原因接种量适当增加。

1.2.3 继代培养 继代培养试验方案见表3。

1.2.4 培养条件 培养室温度为(25±2) ℃，湿度为60%～70%，光照强度为1200～1400 lx，每天光照时间为12 h。

表1 消毒方法正交试验设计

表2 不同培养基配方对茎段芽诱导正交试验设计

*：培养基配方为蔗糖(分析纯)30 g·L-1，琼脂5.5 g·L-1，pH值在5.6～6.0范围内。下同。

1.3 数据收集及处理

运用SPSS 17.0进行数据处理，大花序桉茎段外植体接入培养基后每2 d进行观察统计，诱导、继代培养20 d时进行调查。调查结果按下列方法统计相关指标。褐化率(%)=褐化的茎段数/接种的茎段总数×100%；污染率(%)=污染的茎段数/接种的茎段总数×100%；诱导率(%)=诱导芽的茎段数/未感染的外植体数×100%；平均芽数量(%)=诱导的芽总数/未感染的外植体总数×100%；增殖系数=收获时的芽苗数/接种时的芽苗数；出芽率(%)=已出芽的茎段数/接种的茎段诱导数×100%。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

不同消毒方法对大花序桉外植体的灭菌效果差别较大(表4)，A5处理消毒效果较好，即2%次氯酸钠浸泡20 min+75%食用酒精表面消毒30 s+0.1%HgCl2深层消毒6 min。这样的消毒方式能够保证较低的褐化率与污染率及较高的诱导成活率且生长良好。

表3 继代培养正交试验设计

*：植物生长调节剂单位均为mg·L-1。

表4 消毒方法对灭菌效果的影响 %

2.2 诱导培养

通过不同培养基对芽诱导效果的影响(表5)分析对比得出，培养基类型为改良MS+6-BA 0.3～0.5 mg·L-1+NAA 0.1～0.3 mg·L-1+KT 0.1～0.2 mg·L-1时，诱导出芽的效果最佳。其诱导率最高达到86%，出芽率最高达到58.1%。

表5 不同培养基对芽诱导效果的影响

表5(续)

*：试验数指参与试验总数；诱导数指除褐化株数外的诱导总数。

2.3 继代培养

通过不同培养基对增殖系数的影响(表6)可以看出，E5、E6、E7、E8的增殖系数较高，可以达到4.5以上(图1、图2)，平均增殖系数为3.6。通过增殖系数来判断最佳的继代增殖培养基配方为：改良MS+6-BA 0.2～0.3 mg·L-1+NAA 0.1～0.2 mg·L-1+KT 0.2～0.3 mg·L-1。

表6 不同培养基对增殖系数的影响

图1 大花序桉1株瓶苗继代增殖培养效果

图2 大花序桉1株继代培养瓶苗切割效果

3 结论与讨论

1)外植体消毒试验结果表明，大花序桉最好的消毒方法为A5处理，即2%次氯酸钠浸泡20 min+75%食用酒精表面消毒30 s+0.1%HgCl2深层消毒6 min。这样的消毒方式能够保证较低的褐化率与污染率及较高的诱导成活率且生长良好。消毒时间过短，无法完全清除外植体上带有的真菌、细菌等微生物；而消毒时间过长，可能会使外植体组织损伤失去活力，导致外植体褐化或死亡。

导致外植体污染的原因有很多，各种微生物可能附着在外植体上，也可能附着在植物体内。组培中使用的培养基通常会添加较高浓度的糖分[7]，从而为外植体上的微生物繁殖和生长提供条件。带菌的外植体一旦接触培养基便能迅速繁殖，并排泄出对外植体有害的代谢毒素，影响茎段芽的正常诱导，导致外植体污染直至死亡。使用HgCl2消毒时，要注意消毒时间的控制，由于其具有较强的毒性，对微生物有很好的杀灭效果，若消毒时间过长，其毒性也会被外植体吸收，导致外植体中毒，甚至死亡。

2)诱导试验结果表明，诱导出芽效果最佳的培养基为：改良MS+6-BA 0.3～0.5 mg·L-1+NAA 0.1～0.3 mg·L-1+KT 0.1～0.2 mg·L-1，诱导出芽的效果最佳。基本培养基的选择对大花序桉组培苗的生长起到关键作用。在选择基本培养基时，除了要考虑植物的遗传特性外，还应考虑培养基总离子浓度、总氮水平及硝态氮和铵态氮的比例、钙和氯化物的含量等。本研究对不同基本培养基和激素配比对芽的诱导培养影响(出芽率)进行分析，可知4种因素对出芽率的影响较大，它们依次为培养基类型、6-BA浓度、NAA浓度、KT浓度。高浓度的KT能够很好地刺激大花序桉组培苗诱导出芽，增殖系数高，但是组培苗茎段较红，出现玻璃化现象等生长不正常现象。

3)通过不同培养基对增殖系数的影响可以看出E5(改良MS+6-BA 0.3 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1)、E6(改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1)、E7(改良MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1)、E8(改良MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1)的增殖系数较高，可以达到4.5以上，平均增殖系数为3.6。通过增殖系数来判断，最佳的继代增殖培养基配方为：改良MS+6-BA 0.2～0.3 mg·L-1+NAA 0.1～0.2 mg·L-1+KT 0.2～0.3 mg·L-1。

为了获得大量的继代增殖培养组培苗，可选择使用较高浓度的细胞分裂素和一定浓度的生长素配比，以提高芽体的增殖率并获得生长良好的芽苗，但在此过程中必须控制好二者间的浓度关系[7]，细胞分裂素的浓度高于一定程度将会降低芽苗的质量，抑制继代增殖效果。

*：本项目得到漳州市林业局韩金发、何水东2位高级工程师；福建农林大学陈礼光副教授；长泰岩溪国有林场张友育高级工程师的大力支持与帮助。在此表示最诚挚的谢意!