高效液相色谱串联质谱法检测绿茶中的非法添加剂孔雀石绿

刘超，景赞，邹沫君，黄志勇，冯慧

（乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山614000）

绿茶是我国传统消费的具有文化底蕴的特色农产品之一[1]，绿茶中不仅富含氨基酸、蛋白质、维生素和矿物质元素，而且含有茶多酚、茶色素、茶多糖等功能性成分[2]，但绿茶储存期较短，价格随着季节的波动也较大。

孔雀石绿具有很好的稳定性，通常作为一种工业合成染料用于丝绸、纸张和皮革的制造，然而，目前有些不法商贩常在过期的绿茶中使用，以增强稳定性，提高绿茶卖相。据报道，孔雀石绿具有高毒素、高残留、致癌、致畸、致突变等副作用，被人体吸收后，积累到一定程度，就可能引发各种疾病，如血压高、心率快、厌食、失眠、肝功能异常等。国内关于孔雀石绿的报道较多，如马宏飞[3]等研究了茶叶渣作为吸附剂，对孔雀石绿的吸附性能；王艳[4]等研究了绿茶微粉对染料亚甲基蓝和孔雀石绿的吸附。这些报道多为对孔雀石绿吸附性能的研究，对绿茶中孔雀石绿检测方法的研究较少。鉴于此，本试验建立了液相色谱串联三重四级杆质谱法检测绿茶中的孔雀石绿。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈，色谱纯，Fisher Chemical提供。PSA，40～60 μm，Dikma提供。C18 粉末，40～50 μm，WELTECH（WUHAN）CO.,LTD提供。乙酸铵，有机纯，天津市光复科技发展有限公司提供。无水硫酸镁，分析纯，成都市科龙化工试剂厂提供，CAS：7487-8362。

孔雀石绿标准物质，北京曼哈格生物科技有限公司提供，CAS：2437-29-8，纯度 99.1%。

1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18（150 mm×3.9 mm）。流动相A，乙腈；B，含0.1%乙酸的5 mmol/L乙酸铵。流速，0.4 mL/min。进样体积，10 μL。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.3 质谱条件

DGU20A-API3200质谱仪，ESI正离子模式，离子源参数见表2。扫描模式为多反应检测（MRM），具体参数见表3。

表2 离子源参数Table 2 Ion source parameters

表3 多反应监测参数Table 3 Multi-reaction monitoring parameters

1.4 标准曲线的配制

1.4.1 标准储备液的制备

精密称取10 mg孔雀石绿标准物至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成1 mg/mL的标准储备液。

1.4.2 标准工作液的制备

准确吸取0.1 mL的储备液至10 mL容量瓶中，用乙腈溶液配置成10 μg/mL的标准储备液。

1.4.3 标准曲线的制备

精密称取空白样品0.5 g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入 5、10、20、25、50、75 μL 标准储备液和 10 mL乙腈，涡旋60 s后，振荡提取5 min，超声提取10 min（功率700 W），期间每隔5 min漩涡震荡30 s，8000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重复上述过程，上清液合并转移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。称取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg无水硫酸镁、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，移取1.5 mL上清液至此离心管中，涡旋混合1 min，以8000 r/min离心5 min，孔雀石绿浓度范围为2、4、8、10、20、30 ng/mL。 取 10 L 标 准 点 浓 度 注 入LC-MS/MS中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积纵坐标，绘制标准曲线并列出线性方程及线性范围。

1.5 样品制备

提取：精密称取试样0.5 g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋60 s后，振荡提取5 min，超声提取10 min（功率700 W），期间每隔5 min漩涡震荡30 s，8000 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL容量瓶中，再加入10 mL乙腈，重复上述过程，上清液合并转移至同一容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

净化：称取 100 mgPSA（40～70 μm）、50 mg无水硫酸镁、200 mg C18粉末置于10 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，移取1.5 mL上清液至此离心管中，涡旋混合1 min，以8000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm的有机滤膜，备用。

1.6 检出限与定量限

精密称取空白样品，空白溶液的制备方法同1.6样品的制备方法。用空白样品溶液将标准工作液稀释至产生3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比（S/N），根据色谱图测得信噪比，计算方法检出限和定量限。

1.7 方法准确性及重复性

低浓度加标回收溶液：称取0.5 g空白样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入一定量标准工作溶液，然后按样品制备方法操作，配置成4 ng/mL的质控样品。

中浓度加标回收溶液：称取0.5 g空白样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入一定量标准工作溶液，然后按样品制备方法操作，配置成10 ng/mL的质控样品。

高浓度加标回收溶液：称取0.5 g空白样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入一定量标准工作溶液，然后按样品制备方法操作，配置成20 ng/mL的质控样品。

1.8 方法精密度

称取3份0.5 g空白样品于3个50 mL聚四氟乙烯离心管中，分别在每个离心管中加入标准工作溶液10、20、50 μL，然后按样品制备方法操作，供试品溶液连续进样6次，计算峰面积的RSD值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

由图1可知，孔雀石绿在2～30 ng/mL浓度范围内，R2值为0.8978，可见，孔雀石绿在该浓度范围内线性良好，因此选取2～30 ng/mL为本试验的线性范围。

2.2 专属性

目标化合物出峰处无干扰，一级质谱图、二级质谱图清晰可见，图2、3说明该方法专属性强。

图1 孔雀石绿的标准曲线Fig.1 Standard curve of malachite green

图2 孔雀石绿一级质谱图Fig.2 MS spectra of malachite green

图3 孔雀石绿二级质谱图Fig.3 MS2 spectra of malachite green

2.3 检出限和定量限

采用空白样品加标准溶液的方法测定[5-8]，孔雀石绿的方法的检出限为1.77 μg/kg，定量限为5.89 μg/kg。

2.4 方法的准确性及重复性

采用空白样品加标准回收法测定[5,7]，取浓度分别为4、10、20 ng/mL的质控（QC）样品 3份，经前处理进样分析，每种浓度平行进样6次，测得3种非法添加物的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度，除以理论加入浓度，获得方法回收率，即准确度结果。测得孔雀石绿的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度及其RSD，获得重复性结果。从表1我们可以看出，孔雀石绿在高、中、低三个水平回收率均为84.2%～93.1%，重复性RSD＜5%。这表明方法准确性及重复性良好。

图4 孔雀石绿标准品色谱图Fig.4 Chromatogram of malachite green

表1 不同质量浓度下的孔雀石绿回收率结果（n=6）Table 1 Recoveries of malachite green at different concentration levels（n=6）

2.5 方法的精密度

表2 方法精密度测定结果Table 2 Method Precision determination results （n=6）

取浓度为 4、8、20 ng/mL的质控（QC）样品 1份连续测定6次。测得孔雀石绿的峰面积代入随行的基质标准曲线，计算浓度。由表2可以看出，孔雀石绿精密度均＜3%，表明仪器精密度良好[5,6]。

3 结论

本试验针对绿茶中孔雀石绿建立了液相色谱-串联质谱检测方法，着重考察了该方法的检出限、定量限、专属性、线性范围、准确性、重复性、精密度等指标。结果显示：该方法在2～30 ng/mL范围内具有良好的线性；方法检出限为 1.77 μg/kg；添加浓度在 4、10、20 ng/mL 三个水平条件下的平均回收率在84.2%～93.1%之间；孔雀石绿重复性＜5%，精密度＜3%。该方法具有操作简单、干扰少、灵敏度高、稳定性好、结果准确等特点，适用于绿茶中孔雀石绿的测定。