葡萄多酚的生理活性及提取方法研究进展

牟萍 ，王兆升 ，范祺 ，张明 ，杨立风 ，马超 ，吴茂玉 *

（1.山东农业大学，山东泰安271018；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南250014）

葡萄（Vitis viniferaL.）为葡萄科葡萄属木质藤本植物，既有为人称道的风味和口感，又具有很好的营养价值。现代科学证实，葡萄中含有矿物质以及多种维生素，还含有多种人体所需的氨基酸，常食葡萄可以抗病毒、改善过敏症状、防癌抗癌、抗贫血、美容养颜等[1]。而葡萄多酚是葡萄重要的次生代谢产物，广泛存在于葡萄的梗、皮、核中，是葡萄中存在的所有酚类物质的总称。研究表明，葡萄多酚具有抗氧化、抗肿瘤、调节心血管系统等生理活性。因其生理功能的多样性，近年来葡萄多酚成为国内外天然产物以及人类保健、医学、健康的研究热点。

目前对于葡萄多酚的研究主要集中在它的提取、纯化以及组分分析和生理活性方面。在众多的植物多酚中，葡萄多酚高效、无毒，具有很强的抗氧化、清除自由基等功能。葡萄在我国使用率高，产量丰富，副产物葡萄籽、葡萄皮剩余量大，因此葡萄多酚主要组分、生理活性、提取和纯化方法及应用等方面的研究对于指导其开发利用、实现变废为宝、提高利用率具有重要意义。

1 葡萄中的主要多酚类物质

表1 葡萄不同部位及其制品中的酚类化合物Table 1 Phenolic compounds in different parts of grape and their products

葡萄中的酚类物质主要存在于葡萄的表皮、茎、叶子和种子中，在种子、表皮、肉和叶子中的浓度分别约为2178.8、374.6、23.8和 351.6 mg/g（没食子酸当量）[2]。目前，包括花色苷、黄酮醇、儿茶素类、白藜芦醇、原花素、花色素以及黄烷酮醇类等十几种多酚类物质已经成功从葡萄中分离鉴定出来[3]。花色苷是植物体内重要的类黄酮化合物，具有清除体内自由基并降低氧化酶活性的功能[4]；黄酮醇重要的生理功能及辅色作用决定了其是葡萄及葡萄酒中除花色苷之外最受关注的类黄酮类化合物，它与葡萄和葡萄酒的营养品质和感官品质的形成密切联系[5]；儿茶素类化合物是一种优良的天然抗氧化剂，抗氧化能力强、安全性高[6]；白藜芦醇存在于葡萄浆果、葡萄干、葡萄汁和葡萄酒中，在医学上具有防癌和防治心血管疾病的作用[7]。

2 葡萄多酚的生理活性

2.1 抗氧化作用

正常生命过程中产生的自由基是维持生命所必需的，但过剩的自由基会对人体内的生命分子造成损害，引发多种疾病，葡萄多酚能够有效地清除人体内过剩的自由基。刘芸等[8]采用铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP法）测定了葡萄皮渣提取物的总抗氧化能力，结果发现FRAP 值为（3.215±0.017）mmol/g；在此基础上，测定其对DPPH、O2－·、OH 、ABTS+等自由基的 IC50分别为 20.5、52.5、566.4、16.8 mg/L，对 β-胡萝卜素/亚油酸体系抑制作用的 IC50为28.2 mg/L，可见，葡萄皮渣提取物具有较强的抗氧化能力。Pataki等[9]对大鼠投喂含有葡萄籽原花青素提取物的饲料3周，通过电子自旋共振光谱法对氧自由基进行测量，发现原花青素能显著抑制氧自由基的形成，给予葡萄籽原花青素提取物100 mg/kg的处理与对照相比，自由基强度降低75%±7%。

2.2 抗癌作用

研究表明，葡萄多酚具有抗癌作用。Agarwal等[10]用葡萄籽多酚处理体外培养的乳腺癌 MDA－MB－468细胞1～3 d，发现其对该细胞增殖具有高度显著的抑制作用，抑制率达90%～100%。Vayalil等[11]通过研究得出，葡萄原花青素会抑制雄激素不敏感性前列腺癌细胞DU145和雄激素敏感性前列腺癌细胞LNCaP的增殖，以及MMP-2和MMP-9这两种金属蛋白酶的表达。

2.3 抑菌作用

葡萄多酚有较强的收敛作用，对多种细菌、真菌都有明显的抑制功效。Sagdicet等[12]研究表明，不同浓度的葡萄渣粗提物在贮藏过程中能够抑制大肠杆菌科和沙门氏菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌以及霉菌、酵母菌和溶脂菌等腐败微生物的生长。李建慧等[13]试验发现，葡萄多酚对普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌1（1884）、金黄色葡萄球菌2、志贺氏痢疾杆菌、伤寒沙门氏杆菌1（533黄）、伤寒沙门氏杆菌2（533白）、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌这8种致病菌的最低抑制浓度分别为 0.2、0.3、0.1、0.2、0.2、0.3、0.5、0.3 g/L，可见葡萄多酚对细菌有广泛的抑制作用，是一种良好的天然抗菌剂。

2.4 调节心血管系统作用

葡萄多酚调节心血管系统的功能也得到了科学论证。连冠等[14]研究了葡萄籽多酚降血脂及抗动脉粥样硬化的作用及机制，得出葡萄籽多酚具有降低小鼠血脂水平和改善动脉粥样硬化的作用。进一步研究发现，葡萄籽多酚降血脂可能与通过胆固醇代谢的代替途径和中性合成途径增加胆固醇转化成胆汁酸、促进脂质的转运有关；抗动脉粥样硬化的机制可能与降低血浆中总胆固醇和甘油三酯水平、减少泡沫细胞的形成有关。Zhao等[15]研究表明，葡萄原花青素具有保护心血管系统的能力，有对抗再灌注性心律失常的作用。

2.5 其他作用

研究证实，葡萄多酚还有降血糖、抗辐射的功效。仇菊等[16]研究表明，长时间注射低剂量的葡萄籽多酚可以有效调节糖尿病大鼠的血糖水平。葡萄籽多酚通过修复胰岛损伤来促进胰岛素分泌、降低空腹血糖水平、改善葡萄糖耐受力，这一功效可能与其体内抗氧化作用相关。蒋宝泉等[17]研究发现，单独添加葡萄籽原花青素组及其与酪蛋白联合干预组血清内毒素水平都明显低于照射组（P＜0.05），这表明葡萄籽原花青素及其与酪蛋白联合干预都对辐射造成的肠黏膜屏障功能损害具有明显的保护作用。

3 葡萄多酚的提取与纯化

3.1 葡萄多酚的提取方法

提取葡萄多酚的方法通常有溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、酶提取法等[18]。试验证实，目前最适用的提取方法是溶剂萃取法；而新兴的一些技术如超临界萃取技术等，由于成本太高也仅限于小规模的科学实验研究，不能广泛应用。但随着天然药物在全球的兴起和技术的进步，这些新兴技术也会被广泛应用到葡萄多酚的提取中。

3.1.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是根据物料中各成分在溶剂中溶解性的不同，选用对待提取成分的溶解度大、而对不需提取成分的溶解度小的溶剂，将有效成分从原料中溶解出来的一种方法。常用溶剂有水、甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液等。Nawaz H等[19]利用含水乙醇提取葡萄籽中的多酚，最佳提取工艺条件是采用5倍体积比的50%乙醇水溶液，在70℃条件下提取60 min。孙玉霞等[20]通过响应面法优化了葡萄枝中多酚的提取条件，结果发现，乙醇水溶液浓度50%、提取温度70℃、料液比 1:16.5，在此条件下提取液中多酚含量可以达到14.126 mg/g。

溶剂萃取法设备简单，操作容易，但提取时间较长，提取率较低，而且所用的有机溶剂很有可能残留在最终的产品中。所以，该法在提高提取率和安全性等方面有待改进。

3.1.2 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是将超声波产生的振动效应、空化效应、搅拌效应、粉碎效应等综合效应应用到天然产物成分的提取工艺中，通过破坏其细胞壁，增加溶剂的穿透力，从而达到高效提取细胞内容物的目的[21]。

姜黎等[22]研究利用超声波辅助提取葡萄皮渣中的多酚，最佳工艺条件为提取温度40℃、料液比1:10、乙醇浓度40%、超声波处理时间30 min、超声频率45 kHz、pH6；在此条件下提取的多酚含量可达17.79 mg/g。

超声波辅助提取法具有提取速度快、得率高、对热不稳定、物质破坏少等特点，将此法应用于多酚的提取会取得很好的效果，但获得产品的纯度不高。

3.1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法的原理是通过微波加热使植物细胞内的极性物质吸收微波能并产生热量，使细胞内温度急剧上升，水汽化导致植物细胞内部的压力也迅速上升，冲破细胞膜和细胞壁形成孔洞；进一步加热导致细胞水分减少，表面出现裂纹，使胞内物质容易从孔洞和裂纹释放出来，而胞外溶剂易进入胞内溶解并释放出胞内有效成分，从而提高提取效率[23]。

李凤英等[24]采用微波辅助提取法，按1:25料液比加入体积分数50%的乙醇，在180 W微波功率下处理35 s，于70℃的水浴中浸提25 min，使多酚的浸提率达到95.02%。同时与常规的溶剂萃取法进行比较，结果发现，微波辅助提取法比传统的溶剂萃取法提取率可提高20.14%，而且经紫外扫描图谱显示，此微波条件对葡萄皮多酚结构没有产生破坏。

微波辅助提取技术作为一种新型的萃取技术，不仅快速、高效、稳定、选择性高，而且节物、节能、环保[25]。但与超声提取相比，微波法只适合短时间内快速提取，长时间提取可能会导致提取液温度过高而使多酚类物质分解，提取量减少。

3.1.4 超临界流体萃取技术

超临界流体萃取技术利用了温度和压力对超临界流体溶解能力的影响。在超临界状态下，将超临界流体与待提取的物质接触，使其有选择性地依次把极性、沸点和相对分子质量大小不同的成分萃取出来[26]。张青松等[27]采用超临界CO2萃取技术，对从酿酒后废弃葡萄皮渣中萃取白藜芦醇的技术进行了研究。以75%乙醇为最佳夹带剂，通过压力、温度、时间的单因素试验和正交试验，研究出了CO2超临界萃取的最佳工艺条件，结果表明：在13 MPa、38℃下萃取17 min的效果最好，在此条件下白藜芦醇平均得率可达0.087%。Ghafoor K等[28]通过响应面法确定出超临界流体萃取葡萄皮多酚的最佳工艺参数，经检测，在此工艺下获得的葡萄皮提取物中具有大于93%的DPPH自由基清除活性。

超临界流体萃取技术具有高效提取、绿色环保等优点，已经在食品工业、医药工业等产业得到了广泛的应用，今后应进一步研究超临界流体萃取技术的影响因素、超临界流体的性质等，在此条件下，超临界流体萃取技术的应用前景将十分广阔[29]。该项技术的不足之处在于投资成本较高。

3.1.5 酶提取法

酶提取法是利用酶反应温和的特点将植物组织进行分解，大大提高提取率，酶法具有节约能源、提取率高、条件温和、除杂和无污染等优点[30]。李浡等[31]用纤维素酶、β-葡聚酶、果胶酶、木瓜蛋白酶以及复合酶提取葡萄皮渣中的总酚并测定含量，结果显示，复合酶提取多酚效果较好，果胶酶提取效果次之。

3.2 葡萄多酚的纯化方法

从原料中提取出来的葡萄多酚属于粗品，要得到高纯度的葡萄多酚或者葡萄多酚单体组分需要对粗品进行提纯。目前常见的对天然活性多酚纯化方法主要有树脂吸附纯化法、高效逆流色谱纯化法、膜技术纯化法、制备HPLC法以及金属离子沉淀纯化法等[32]。

3.2.1 树脂吸附纯化法

树脂吸附纯化法是将粗提取液通过大孔树脂，吸附其中的有效成分，再经洗脱回收，去除杂质的一种纯化方法。大孔树脂的表面积较大、机械强度高、交换速度较快、热稳定好，在水溶液及非水溶液中都能使用；同时它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、使用周期长、不受无机物存在的影响、解吸条件温和、费用低等众多优点[33]。

张静等[34]通过静态、动态结合的方法，以葡萄多酚类物质吸附量、吸附率和解吸率为指标，确定出了ME-1型树脂是最佳的型号，其最佳吸附洗脱参数如下：在葡萄多酚含量17.335 mg/g，吸附流速2 mL/min的条件下，树脂静态吸附平衡时间为10 h，动态吸附最大上样量为400 mL，动态洗脱蛋白质和多糖的蒸馏水用量分别为1300 mL和150 mL，洗脱剂为体积分数75%的乙醇，其用量为100 mL时的洗脱效果最好，此时葡萄多酚类物质的回收率可达84.8%。杜彬等[35]以 NKA-9、D101和NKA-II这3种大孔吸附树脂作为吸附剂纯化白藜芦醇，实验表明，由NKA-9大孔吸附树脂填充的色谱柱效果最好，动态饱和吸附量约为2.31 mg/mL湿树脂；解吸用75%的甲醇，在解吸流速1 mL/min、pH值为8的条件下，白藜芦醇可被较好的纯化。

3.2.2 高速逆流色谱纯化法

高速逆流色谱法是利用互不相溶的两相在螺旋管中进行高速行星式运动，使被分离纯化的物质在两相之间多次分配，从而实现短时间对混和物的高效分离和制备。由于高速逆流色谱法不需要固定相，因此克服了固相载体对样品的污染、吸附和峰拖尾等缺点，而且使得样品回收率较高[36]。罗兰馨等[37]采用正己烷-乙酸乙酯-水（1:50:50）为溶剂系统对白葡萄皮多酚粗提物进行高速逆流色谱技术分离，结果高速逆流分离得到3个馏分，经制备液相分离得到6个多酚化合物单体，经质谱鉴定和对照品对照，鉴别为儿茶素、表儿茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、fertaric acid和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，其纯度均大于90%。李媛媛等[38]采用高速逆流色谱法分离红葡萄皮中的花色苷，以乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1:40:1:50:0.01，V/V）为溶剂体系，可得到纯度分别为93.7%、95.2%、91.6%的飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍药色素-3-O-葡萄糖苷三种花色苷单体化合物。

3.2.3 膜技术纯化法

膜技术纯化法是天然或人工合成的高分子薄膜以浓度差、压力差、温度差和电位差等外界能量位差为推动力，对双组分或多组分的溶质及溶剂进行分离、分级、提纯和富集的一种分离纯化方法。膜技术纯化法具有简单、节能、高效、易于操作、造价较低等特点，可代替传统的蒸发、精馏、结晶、萃取等方法[39]。陈文良等[40]开展了膜分离技术用于葡萄籽中低聚原花青素分离纯化的工艺研究，结果表明：操作压力在1.0 MPa的条件下，采用10万道尔分子量规格的膜是最佳选择。此时具有较大的膜通透性，产品的截留率低，为6.2%，且产品中的低聚原花青素含量较高。

3.2.4 制备型液相色谱法

制备型液相色谱法（HPLC）是利用组分在固定相和流动相中分配系数的细微差异，当两相进行相对运动时，不同组分将形成不同迁移速度的谱带，使得组分之间彼此分离，从而达到分离的目的。制备HPLC法由于具有分辨率高等优点，在未来势必会成为天然产物分离的重要手段之一[41]。王维茜等[42]采用HP-20树脂和半制备型高效液相色谱结合的方法从刺葡萄中分离得到2种花色苷单体，分别是锦葵素-3,5-O-双葡萄糖苷和锦葵素-3,5-O-双葡萄糖苷-香豆酰，纯度为99.54%和98.28%。

3.2.5 金属离子沉淀纯化法

通常采用金属离子沉淀纯化法，将植物多酚的粗提溶液与相应的金属离子产生络合沉淀，经过后续过滤、洗涤等处理，得到纯度较高的植物多酚。金属离子沉淀纯化法具有设备简单、成本低等优点，但需要经过沉淀、洗涤等工序，操作比较麻烦。除此之外，有些组分的沉淀分离选择性比较差，分离不够完全，所得的产品纯度也相应较低[43]。时国庆等[44]以葡萄籽为原料，利用溶剂法（70%乙醇）结合冷却沉淀法（4℃、1 h）和盐析法（加入6 g NaCl），调节澄清液pH值为3.5，用乙酸乙酯萃取，对原花色素提取物进行分级分离。

4 葡萄多酚的应用

葡萄多酚丰富的生理活性，使之在医学、食品、化妆品领域有广泛的应用前景。

4.1 在医学方面的应用

首先，葡萄多酚良好的抗氧化能力可以在阻止血脂升高的同时提高低密度脂蛋白的含量，所以对心血管疾病有一定的治疗作用。Meunier等国外学者将葡萄多酚应用于降低高血压，结果证明，葡萄多酚可以抑制血管紧张素转换酶（ACE）的活性，从而降低血管紧张素Ⅱ的含量，使血压控制在一定水平。不仅如此，葡萄多酚还具有抗癌的功效，其也被应用在预防食道癌、乳腺癌、肠癌等癌症疾病；此外，葡萄多酚也被应用到降血糖、抗过敏、抑菌等方面。

4.2 在食品方面的应用

在食品领域，葡萄多酚的应用主要体现在以下几个方面。首先，葡萄多酚的相关食品逐渐被开发出来。李凤英等[45]以葡萄籽浸提液、脱脂乳粉为原料，研制出葡萄多酚酸奶。其次，目前已经有葡萄多酚作为食品添加剂添加到食物中解决食品的氧化等问题。例如肉制品在贮藏过程中会因脂肪氧化而变质，将葡萄多酚应用到其中会提高保鲜效果。Ahn等[46]将1%的葡萄籽多酚应用到熟牛肉的冷藏中，有效抑制了病原微生物的生长并降低了牛肉中脂肪的氧化产物，且没有使牛肉发生褐变。

4.3 在化妆品方面的应用

葡萄多酚抗氧化、抗菌、抗辐射及抗衰老的生理活性使其在化妆品领域也有广泛的应用，越来越多的葡萄多酚相关洗化产品被开发出来。如法国以低聚体原花青素为原料开发出的脂质体微胶囊晚霜、漱口水等；日本已开发出含葡萄籽多酚的皮肤免疫力增强剂、皮肤增白剂、口腔除臭剂等产品；我国也出现了葡萄多酚面霜、沐浴露、护手霜等相关产品。

5 小结

目前，葡萄多酚提取及纯化等技术日臻成熟，再加上生理活性的多样性，使得葡萄多酚在医学、食品和化妆品等领域的应用越来越广泛。而我国的葡萄种植面积很大，在葡萄日常管理中会产生很多修剪的枝条、丢弃的废果，在我国葡萄酒产量猛增的同时，每年产生的葡萄皮渣也有数万吨，如果把这些葡萄废弃物当作垃圾丢弃或焚烧都会对环境造成很大的污染。在葡萄废弃物中进行多酚类物质的提取研究将对提高葡萄资源的综合利用、保护环境起到重要作用。

总而言之，作为一种天然又高效的活性物质，葡萄多酚越来越被人们重视。随着人们对葡萄多酚研究的不断探索，其应用必将越来越广泛。