同型半胱氨酸致心血管疾病氧化应激机制的研究进展

张仲迎，高歌，李莹，郝立晓，佀思聪，魏占云，李耘

同型半胱氨酸（Hcy）是一种含硫的非必需氨基酸，是由甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的中间产物[1]。有研究显示，Hcy及其再甲基化过程中的产物S -腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）可能是动脉粥样硬化性心血管病的独立危险因素[2]，亦与骨质疏松[1]、帕金森、抑郁、认知功能受损等疾病相关[3]。Hcy致心血管疾病的分子生物学机制尚不明确，可能通过影响一氧化氮合成[4]、下调硫化氢信号通路[5]、激活氧化应激机制、干扰脂质代谢[6]、蛋白质的同型半胱氨酸化[7]、DNA及RNA的低甲基化[8,9]等机制导致血管内皮损伤及动脉粥样硬化形成。

氧化应激通过氧化作用、促进局部炎症反应、损伤血管内皮细胞、诱导血管基因的改变和参与影响信号转导途径等多方面参与心血管疾病的发生及发展过程。近年来有研究显示，氧化应激机制在Hcy影响血管内皮功能及致动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用。本文将主要从Hcy影响氧化应激、Hcy影响内质网及线粒体应激、抗氧化应激干预治疗及展望几个方面进行文献总结。

1 氧化应激、内质网应激和线粒体应激

1.1 氧化应激氧化应激指的是体内活性氧类（ROS）及活性氮类（RNS）生成过多，与抗氧化防御间的平衡紊乱[10]，即氧化程度超出氧化物的清除能力，从而导致组织损伤。ROS包括超氧阴离子（O2-）、羟基自由基（OH-）和脂自由基（ROO-）等[11]。其来源主要包括胞浆（环加氧酶、NADPH氧化酶等）、线粒体呼吸链（电子传递系统）、内质网（细胞色素P450单加氧酶）及胞质（黄嘌呤氧化酶）。RNS包括一氧化氮、二氧化氮和亚硝酸等，主要通过一氧化氮合成酶及黄嘌呤氧化酶催化产生。细胞内抗氧化系统分为酶类和非酶类两种，酶类包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、对氧磷酶 1（PON1）等，非酶类抗氧化物包括脂溶性抗氧化剂（维生素E、类胡萝卜素、辅酶Q、胆红素）、水溶性小分子抗氧化剂（维生素C、谷胱甘肽）、蛋白性抗氧化剂（铜蓝蛋白、金属硫蛋白）[10,12]。

在细胞水平，ROS可通过：丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途径（包括ERK、JNK和p38激酶三个亚族）、PI3K/AKt途径、磷脂酶C和蛋白激酶C途径、NF-κB途径[13]、生长因子信号通路、Ca2+信号转导调控、JAK/STAT途径、c-Abl酪氨酸激酶、p66shc适配蛋白及热休克蛋白的表达等信号转导途径改变基因表达从而导致细胞的凋亡。

氧化应激过程中生成的ROS可激活NF-κB，NF-κB活化后可与细胞核内的κB位点结合，诱导多种炎症因子及黏附介质的基因表达，包括细胞因子中的IL-2、IL-2α、IL-6、IL-8、CSF、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1及E-选择素等[13,14]。炎症因子的过度释放和表达，可引发内皮细胞的损伤及凋亡，增加中性粒细胞及单核细胞对内皮细胞的黏附性，最终引起血管通透性增加，血管内血栓形成[15]。ROS还造成内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）解偶联，产生O2-，造成NO生物利用度降低及氧化应激增加，加重内皮功能障碍[16]。此外，ROS亦可干扰脂质代谢，导致LDL被氧化修饰成ox-LDL，加速动脉粥样硬化的进程。SOD活性下降引发脂质过氧化物催化裂解产生丙二醛（MDA），MDA可与蛋白质分子内和分子间交联、抑制线粒体电子传递链系统，诱发细胞凋亡[12]。ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位C原子结合-OH而产生8-羟基脱氧鸟苷（8-OH-dG），是评价DNA氧化损伤和氧化应激的分子生物学标志物[17]，与心血管疾病患病相关[18]。

抗氧化防御体系中，Keapl/Nrf2信号通路起重要作用。应激状态导致Keapl构象的改变，使Nrf2与Keapl解离而活化，活化的Nrf2进入细胞核，形成下一步连锁反应，从而与抗氧化反应元件(ARE)的结构相结合，激活下游的多种抗氧化基因[19]，表达蛋白包括血红素氧合酶-1（HO-1）、SOD、NAD(P)H 醌氧化还原酶（NQO1）及GSH-Px等，其中HO-1通过血红素生成胆红素、一氧化碳和亚铁离子，并能增加NO的生物利用度，从而发挥抗氧化损伤和心血管保护作用[20]。

1.2 线粒体氧化应激线粒体是细胞进行生物氧化和能量转换的重要细胞器[21]，生物体内的ROS主要来源于线粒体的氧化磷酸化作用[1]。作为细胞内ROS的主要来源，线粒体结构暴露于高浓度ROS下，导致电子传递链酶复合体Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ活性下降，从而使线粒体能量合成障碍，造成线粒体及细胞内的蛋白质、脂类及核酸的氧化，破坏线粒体膜的完整性，最终导致线粒体功能障碍。

ROS可激活线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放[22]，促进细胞色素C（Cyt c）的释放，与凋亡激活因子-1结合，启动Apaf-1、Caspases-9、Caspases-3细胞凋亡级联反应，诱导细胞凋亡[23]。

1.3 内质网氧化应激内质网是进行蛋白质、脂质和胆固醇合成的重要细胞器，也是细胞内主要的钙存储场所。细胞内外环境的改变导致内质网腔内未折叠蛋白的聚集和钙稳态破坏，这种内质网功能紊乱状态称为内质网应激（ERS）[24]。

ERS反应包括未折叠蛋白反应（UPR）、内质网过度负荷反应和固醇调节元件结合蛋白质通路调节的反应。ERS是一种自我保护机制，但是过度的ERS使内质网腔内压力增大，钙稳态不能恢复，引起细胞凋亡。ERS诱导的细胞功能障碍和凋亡是血管变异的重要因素，包括动脉粥样硬化。

UPR是由未折叠蛋白在内质网腔内的聚集诱导内质网伴侣蛋白如78kDa糖调节蛋白（GRP78）/免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）、GRP94等的表达上调。IRE1、PERK和ATF6是内质网膜上的3种重要的应激感受蛋白，无ERS时，IRE1、PERK和ATF6分别与内质网分子伴侣GRP78/Bip结合而处于无活性状态。当ERS时，未折叠蛋白的堆积使GRP78/Bip从3种膜蛋白上解离，转而与未折叠蛋白结合，恢复内质网的功能[25]。但过度的ERS会引起这三个信号通路启动细胞凋亡信号通路，激活下游的凋亡信号分子，如CHOP/GADD153，JNK及Caspases-12等[24]。以IRE1为例，IRE1能剪接XBP1的前体mRNA，编码有活性的转录因子XBP1，可启动C/EBP 同源蛋白（CHOP）转录与表达，从而诱导细胞凋亡。

2 同型半胱氨酸与氧化应激的相关研究

Hcy可通过上调NADPH氧化酶的表达及其巯基（-SH）自动氧化成O2-、OH-等ROS物质[26]，在心血管内皮细胞[27]、骨骼肌细胞[28]、血管平滑肌细胞、肝细胞及脑细胞等多部位诱导氧化应激，并能够下调抗氧化应激防御系统，最终诱导细胞凋亡。

2.1 氧化/抗氧化应激系统Hcy同时升高ROS和RNS水平[29,30]，Zhai等[1]将50、100及300 μM不同浓度的Hcy作用于MC3T3-E1成骨细胞，结果发现：Hcy呈浓度依赖性地促进ROS的生成。研究发现，Hcy与内皮细胞eNOS解偶联相关，从而导致超氧阴离子而不是NO的产生[16]。Hcy可通过上调NADPH氧化酶的表达[31]从而升高ROS水平，NADPH氧化酶通过NOX家族编码，NOX2是血管内皮细胞的优势亚型，在人内皮细胞和鼠心肌细胞中Hcy水平与NOX2的表达相关[32]。以L-甲硫氨酸喂养小鼠致Hcy升高诱导MDA水平上升，NF-κB及其下游前炎症因子被激活，且通过抑制AKt通路和线粒体依赖的凋亡通路导致小鼠主动脉内皮细胞凋亡[33]。

Hcy水平与急性时相反应物相关，既往有研究显示IL-1ra及IL-6可预测不稳定型心绞痛患者住院期间的急性冠脉事件[34]。Gori等[15]调查了意大利一个65岁以上老年人群共1320人，研究发现Hcy浓度与IL-1ra、IL-6相关，Hcy重度升高（＞30 μmol/L）及Hcy中度升高（15～30 μmol/L）相比Hcy正常（＜15 μmol/L）的老年人，IL-6出现高三分位数的风险分别增加了2.6倍（OR=2.6，95%CI：1.1～5.6）及1.6倍（OR=1.6，95%CI：1.2～2.2），且独立于其他常见心血管疾病危险因素，该研究部分解释了Hcy与动脉粥样硬化性心血管疾病的关系。

有研究显示，Hcy导致抗氧化应激系统下调而致氧化应激失衡[12,35-38]，Hcy可下调抗氧化系统酶HO-1、CAT及SOD-1的表达[1]。在心血管病患者中，高Hcy血症与GSH下降相关，且伴随维生素B12和维生素E减少[39]。高Hcy血症致人内皮细胞及鼠模型中GPx（GPx-1和GPx-2），SOD（SOD1和SOD2）及硫氧还原蛋白的表达下降[36]。Guo等纳入了新诊断的H型高血压（高Hcy血症合并原发性高血压）患者、新诊断的高血压Hcy正常患者及年龄匹配的健康对照者各50例，与对照组比较，两个高血压组的MDA更高、SOD及CAT水平更低；在高血压亚组中，Hcy升高组的MDA较Hcy正常组高（8.3±1.8 μmol/Lvs. 6.5 ±1.3 μmol/L；P＜0.05）、SOD活性更低（120.5±13.7 U/mlvs. 131.3±18.2 U/ml；P＜0.05）；在高血压患者中，Hcy水平与MDA（r=0.47，P＜0.05）、SOD（r=-0.51，P＜0.01）及CAT（r=-0.51，P＜0.05）相关，研究提示H型高血压能够抑制抗氧化应激系统，因此可能是更易导致心血管疾病的高血压表型[12]。

2.2 氧化应激通路Hcy可通过ROS诱导激活JNK途径引起骨髓间充质干细胞凋亡，提示高Hcy血症相关的心血管疾病可能通过分子机制进行干预[40]。Zhang等[30]研究发现，Hcy可通过PI3-K/Akt信号转导通路诱导小鼠巨噬细胞系264.7细胞的氧化应激、炎症反应及上调MAPKs（ERK1/2，JNK and p38）。

Hcy及其前体AdoHcy可通过上调人血管内皮细胞及Apo-E基因缺陷鼠模型的NF-κB通路促进下游前炎症因子如IL-1β、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及E-选择素的释放[14,35,41]。Barroso等进一步研究发现，AdoHcy在人冠状动脉内皮细胞聚集激活经典及非经典NF-κB通路，降低Zeste基因增强子同源物2（EZH2）的水平并减少组蛋白3赖氨酸27的三甲基化（H3K27me3），导致内皮细胞粘附因子和细胞因子的上调，并且这种这种上调可以被NF-κB抑制剂IkB所抑制[13]。此外，AdoHcy介导的甲基化失衡还可能会通过表观遗传学机制破坏氧化还原平衡，AdoHcy在人内皮细胞聚集可降低Sec-tRNA的甲基化程度，改变硒蛋白子集的表达，其中就包括GPx表达下降[35]。

3 同型半胱氨酸与内质网应激及线粒体应激

3.1 线粒体应激Hcy可增加Cyt c从线粒体释放到细胞质、通过Caspases-1炎性体激活及线粒体功能障碍诱导血管内皮细胞凋亡[1,23]。在鼠缺血脑模型中，Hcy通过调控ROS/pSTAT3信号通路，抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅲ酶活性、增加细胞色素C的释放，导致8-OHdG及mitoStat3蛋白磷酸化水平升高，加重了脑皮质和海马的齿状回内质网超微结构损伤[42]。

3.2 内质网应激Hcy可能通过干扰二硫键的形成和激活未折叠蛋白反应诱导ERS，而ERS诱导的细胞功能障碍和凋亡是致动脉粥样硬化的重要因素[43]。

Hcy作用于人内皮细胞可增加GRP78、CHOP的表达以及XBP1mRNA剪接[44]，并增加膜联蛋白Ⅴ-阳性细胞数（细胞凋亡指标），提示Hcy诱导内质网应激和细胞凋亡[45]。高Hcy可激活血管内皮细胞ERS反应，引起JNK活化导致血管内皮细胞凋亡，促进动脉粥样硬化的发生。

4 抗氧化应激的干预治疗

越来越多研究显示，通过减轻Hcy诱导的过度的氧化应激、内质网应激及线粒体应激可能成为心血管疾病的潜在治疗手段[45]。

白皮杉醇是一种化学结构类似于白藜芦醇的化合物，通过抗氧化、抗炎症反应发挥其心血管保护作用。Kil等[45]研究发现白皮杉醇可抑制Hcy诱导的CHOP表达，并通过激活Nrf2通路增加HO-1的表达，抑制Hcy诱导的ROS生成、内质网应激和内皮细胞凋亡。

虾青素是一种脂溶性的酮式类胡萝卜素，可抑制Hcy诱导的mtPTP开放，通过调节MAPKs及PI3K/AKT通路减轻Hcy导致的细胞凋亡，保护线粒体功能[22]。安石榴苷是石榴多酚中主要的活性成分，在高Hcy鼠模型中，Hcy与脑组织SOD、CAT、GSH-Px及GSH水平下降有关，补充安石榴苷可降低MDA及羰基蛋白含量，减少脑细胞促凋亡蛋白Bax，caspases-3, 9及p53，改善氧化应激平衡，减少脑细胞凋亡[46]。其他姜黄素[47]、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）[48]等抗氧化剂、维生素C及骨化三醇[49]亦显示可改善Hcy所导致的氧化应激失衡状态。

Hcy轻度升高的大鼠（10～15 μmol/L）相比对照组，IL-1β、IL-6水平升高，CAT及SOD活性下降导致蛋白和DNA损伤，阿司匹林可改善Hcy升高的CAT活性并降低前炎症因子水平，可能对Hcy引起的脑细胞氧化应激损伤有作用[50]。

硫氢化钠（NaHS）可以逆转Hcy诱导的硫化氢（H2S）产生减少、ROS生成过多及对于抗氧化酶（HO-1、CAT、SOD-1）的抑制，可逆转Hcy诱导的Keap-1表达下降及Cyt c从线粒体释放至细胞质诱导的细胞凋亡[1]。

运动训练可上调内源性抗氧化系统，减轻氧化应激的损伤。不同运动类型对于Hcy的影响研究结果不同，一般强度运动可减少Hcy的水平而有氧运动则未发现这种影响[51]。Oliveira等发现，合并高Hcy血症的艾滋病病毒感染者进行16周的复合运动（有氧运动结合力量训练）相比对照组可减少32%的Hcy浓度并可减少脂质过氧化物浓度，提示复合运动可能会通过降低Hcy及改善氧化还原平衡来预防Hcy相关的心血管疾病。在高Hcy鼠动物模型，运动也可通过抑制Hcy导致的氧化应激改善主内皮细胞功能及动脉粥样硬化的发展[33]。

中药方面，丹参水溶性提取物可通过MARK和NF-κB信号通路抑制内皮细胞凋亡。丹参和三七6:4配伍作用于Hcy-Ado-肿瘤坏死因子诱导的人心血管内皮细胞，有保护内皮细胞活性、减少乳酸脱氢酶释放和Casepase-3释放的作用，并且有协同效应。

5 展望

基础研究及流行病学研究均显示Hcy与心血管疾病相关，但针对人群的随机对照研究结果则争议很大。值得注意的是，绝大多数随机对照研究均采用补充B族维生素的方法，可能叶酸本身也有一定的心血管不利作用（动脉粥样硬化中的炎症反应及增殖），在一定程度上抵消了降低Hcy带来的获益[52]。此外，补充B族维生素降低血液循环中的Hcy，但是这种降低程度是否降低细胞内的有效Hcy浓度并抑制Hcy致心血管疾病的分子生物学机制则并不明确[53]。Hcy可能通过氧化应激机制参与心血管疾病发生发展的过程，未来可通过多种干预手段通过抑制Hcy诱导的氧化应激机制行心血管病的防治研究。