外泌体与缺血性卒中的研究进展

2019-01-04展珊珊王毅飞综述锦审校

中风与神经疾病杂志 2019年2期

展珊珊，王锐，王毅飞综述，付锦审校

脑血管疾病是危害人类健康的重大疾病，全球每年约有1500万人患有脑卒中，约有500万人死亡，是造成死亡的第二大病因,也是长期致残的主要原因[1]。脑卒中分为缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中占全部卒中的73%～86%[2]。对于缺血性卒中目前除了超早期静脉溶栓或血管内治疗外尚无有效治疗方法。近年来，外泌体因其独特的特点而受到广泛关注如低免疫原性、低毒性和生物降解性、穿越血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)的能力等，在缺血性脑卒中的诊断预后及治疗中发挥重要作用。

1 外泌体特点及标志

外泌体是细胞外囊泡的一种，直径约为30～100 nm。外泌体通常包裹在脂质双层膜中，脂质双层膜用于运输和保护外泌体腔内物质免受细胞外环境的破坏[3]。2007年Valadi等人首次证实外泌体内存在RNA，包括mRNA及miRNA和其他非编码RNA[4]。之后又发现外泌体还携带单链DNA、双链DNA、扩增的致癌基因序列、转座因子和线粒体DNA[5,6]。外泌体还可以携带蛋白质和多肽。在外泌体携带的蛋白中一些为常见蛋白质与细胞类型无关，目前认为CD9、Alix、CD63、TSG101和CD81都可以用来作为外泌体识别或区别其他细胞外囊泡的标志蛋白[4,7]。还有一些涉及外泌体生物发生的、表现出组织/细胞类型特异性的蛋白质[7]，目前研究表明，外泌体内含有多种参与脑修复功能的蛋白质，包括突触传递和轴突生长等[8,9]。

人体几乎所有的细胞中均可释放出外泌体，并且广泛存在于人体体液中，在特定条件下在体液中远距离传播[3]。最近发现，在卒中后炎症的条件下[10]，外泌体通过被脑微血管内皮细胞内吞作用将其内化后穿越BBB进入中枢神经系统。

2 外泌体作为缺血性卒中的早期诊断及预后的标志物

缺血性脑卒中时外泌体可从脑神经细胞中合成释放并可通过BBB在外周血中检测到。此外，血液细胞和内皮细胞也可在脑卒中后作出应答并释放外泌体到血液中。因此，外泌体可能是反映病理进展和促进卒中恢复的生物标志物。

Ji等人[11]纳入65名急性缺血性卒中患者以及66名非卒中志愿者作为对照组。通过检测脑源外泌体miR-9和miR-124表达水平。发现与对照组相比，急性缺血性卒中患者血清外泌体浓度以及血清脑源外泌体miR-9、miR-124中位数水平显著升高。并且血清外泌体miR-9和外泌体miR-124水平与NIHSS评分、梗死体积呈正相关。因此，血清脑源外泌体miR-9和miR-124是诊断缺血性卒中和评估缺血性损伤程度的有前途的生物标志物。Chen等人[12]也发现血清外泌体miR-223可作为急性缺血性脑卒中发病72 h内血清标志物，其表达水平与发病时NIHSS评分呈正相关，并且血清外泌体miR-223表达水平高，患者短期预后差。

在溶栓时间窗内TIA与缺血性脑卒中的鉴别是困难的。应用最新的成像技术虽然可以在时间窗口内诊断TIA，但是其检查时间延迟和价格昂贵。有研究[13]通过TUNEL检测在不同缺血时间的脑组织凋亡情况，发现脑缺血5 min时凋亡发生与假手术组无统计学差异，而脑缺血10 min时与假手术组及脑缺血5 min组相比凋亡明显增加。同步检测血清及脑脊液外泌体miR-122-5p和miR-300-3p表达发现血浆外泌体miR-122-5p在假手术组及脑缺血5 min组表达无明显差异而脑缺血10 min组表达升高，miR-300-3p在脑缺血5 min组与假手术组相比表达升高而在脑缺血10 min组表达又减少。提示外泌体miR-122-5p和外泌体miR-300-3p可能是TIA的生物标志物。

缺血性脑卒中依据发病时间可以分为不同阶段，早期、准确的诊断可大大改善患者预后。缺血性脑卒中后有许多生物标志物，如蛋白质、核酸或代谢物，它们可能与缺血性脑卒中的特定生理和病理过程有关，然而它们的特异性和区分脑卒中不同阶段特别是超急性期或类卒中的能力尚不确定[14]。Wang等人[15]研究血浆来源外泌体miR-21-5p和外泌体miR-30a-5p在缺血性脑梗死不同时期的表达情况。研究发现外泌体miR-21-5p和miR-30a-5p是诊断缺血性脑梗死和鉴别缺血性脑梗死超急性期(小于6 h)、亚急性期(8～14 d)和恢复期(大于14 d)的有价值的生物标志物，尤其是miR-30a-5p可用于缺血性脑梗死超急性期的诊断，进而对缺血性脑梗死的溶栓治疗中的可能具有临床价值。

值得注意的是，虽然循环miRNA和外泌体miRNA都是缺血性卒中的新的潜在血清标志物，循环miRNA包含外泌体miRNA，但二者不一定具有相关性。一项研究[16]在大鼠短暂性脑缺血模型及大鼠永久性缺血模型中定量测定血清外泌体miR-126总水平，同时测量梗死和神经预后。结果表明，无论在永久性还是暂时性缺血模型中，外泌体miR-126缺血后不同时间点变化相同。而血清miR-126在永久缺血模型与短暂缺血模型缺血相同时间段变化不同。这说明虽然循环miRNA和外泌体miRNA都可作为缺血性卒中的血清标志物，即使在同一疾病过程中的同一个循环miRNA或外泌体miRNA二者表达存在不同机制。

内皮细胞及血小板在动脉粥样硬化脑梗死发生发展中发挥重要作用。Edward等人[17]在18例缺血性脑血管病患者及年龄和性别匹配的18例对照者中检测内皮细胞来源外泌体和血小板来源外泌体中蛋白表达情况，发现在缺血性脑血管病患者中无论是血浆中的促动脉粥样硬化蛋白还是内皮细胞或血小板来源的外泌体中促动脉粥样硬化蛋白表达水平明显高于对照组。此外，与对照组相比，内皮细胞来源外泌体中YAP蛋白水平较高，P(S127)-YAP蛋白表达水平较低，这与动脉粥样硬化中机械力敏感系统活性增强是一致的。这表明检测外泌体蛋白及其来源作为生物标志物具有潜在的临床价值。

3 外泌体与缺血性卒中的治疗

干细胞为治疗缺血性脑卒中被证明可改善神经系统预后。近期研究表明干细胞治疗缺血性脑卒中疗效的主要机制不是通过细胞替代或移植细胞分化到脑细胞来介导的，而是通过干细胞分泌旁分泌因子促进缺血性脑卒中后神经系统症状改善[18]。因此，卒中后静脉注射无细胞间充质干细胞外泌体治疗为脑卒中提供了一种新的治疗方法，具有替代细胞治疗的潜力。

Xin等人[19]体外在间充质干细胞(MSCs)细胞中过表达miR-133b后提取外泌体(Ex-miR-133b+)给与MCAO大鼠治疗，通过绿色荧光蛋白标记外泌体显示，来自MSCs释放的外泌体miR-133b向星形胶质细胞和神经元的转移，调节基因表达，进而有利于脑卒中后神经突出重塑和功能恢复。进一步对Ex-miR-133b+改善了卒中后神经功能恢复机制研究发现[20]，与Ex-Naive治疗相比Ex-miR-133b+显著增加OGD后星形胶质细胞释放的外泌体。与使用Ex-Con处置的OGD星形胶质细胞外泌体相比，使用Ex-miR-133b+处置的OGD星形胶质细胞获得的外泌体治疗能显著增加培养的大鼠皮质胚胎神经元的神经突分支和伸长。这表明，Ex-miR-133b+外泌体能通过刺激星形细胞释放神经外泌体，进一步增强治疗效果。

Xin等人另一项研究[21]在大鼠大脑中动脉阻塞模型中(MCAo)尾静脉注入从体外MSCs中提取的外泌体，发现从体外MSCs中提取的外泌体显著增强神经突重塑、神经发生和血管生成，改善卒中大鼠的功能恢复。之后又后续报道[22]体外收集过表达miR-17-92簇的MSCs来源外泌体给与大鼠脑缺血模型后尾静脉注射，发现体外过表达miR-17-92簇的MSC来源的外泌体与MSC来源的外泌体相比可显著促进卒中后神经可塑性和功能恢复。由此可见，通过调控外泌体内分子可以增强疗效。

Xiao等人[23]在骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)外泌体与OLs共培养后进行OGD处理，发现标记的BMSCs来源的外泌体miR-134通过直接抑制caspase-8的表达和活性显著抑制OLs细胞凋亡。

脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)已被证实可促进脑卒中后脑血管重构。Yang等人[24]通过体外模型证实ADSCs-Exos促进体外OGD后BMECs血管生成，并且外泌体来源的miR-181b-5p在体外通过直接靶向抑制TRPM7促进OGD后BMEC血管生成。

在脑卒中后的恢复期，轴突再生与功能恢复有关，但轴突再生受到星形胶质细胞瘢痕形成的抑制。Hira等人[25]研究发现在脑缺血动物模型中使用Sema3A抑制剂(Sema3A-I)可促进神经功能恢复及减少活化的星形胶质细胞。进一步研究表明Sema3A-I促进神经功能恢复机制是通过促进星形胶质细胞分泌的外泌体对神经轴突发挥的作用。

除卒中后静脉注射无细胞间充质干细胞外泌体治疗方式外，近期带有靶向能力的装载分子或药物的外泌体治疗是一种新的外泌体治疗方式。

Yang等人[26]通过带有神经元特异性靶向的Lamp2b-RVG修饰外泌体中转染miR-124模拟物，之后对缺血小鼠模型进行静脉注射治疗，发现带有miR-124的Lamp2b-RVG修饰外泌体可以明显定位到受损脑区，并且促进大脑皮质的神经祖细胞转化神经元表型,并通过强健的皮质神经发生保护缺血性损伤。

最近有研究者[27]通过一种简单、快速和生物正交化学方法将c肽(RGDyK)与外泌体表面结合。构成cRGD-Exo。在MCAO小鼠模型中，cRGD-Exo在静脉给药后有效的靶向缺血性脑损伤区域。

因此，修饰后的外泌体可用于靶向脑组织并输送基因药物进行治疗，具有很大的临床应用潜力。