生物标志物在子宫颈癌筛查中的应用进展

徐书航 化定超 王新宇

随着子宫颈癌筛查的普及和癌前病变的处理进一步规范，子宫颈癌的发生率和死亡率大大降低，美国癌症统计报告显示，2017年全美地区子宫颈癌新发病例13 240例，死亡人数4 170例[1]。目前子宫颈癌筛查主要依靠宫颈脱落细胞学检查和高危人乳头瘤病毒（highrisk human papillomavirus，HR-HPV）检测，然而宫颈脱落细胞学检查灵敏度较低，仅60%左右，HR-HPV检测虽有较好的灵敏度，但特异度较低。两种筛查方式的不足易导致漏诊或部分患者的过度治疗。即使在发达国家，依靠目前的筛查手段仍不能达到完全消灭子宫颈癌的目的，仍需探索更有效的技术来优化筛查。

研究发现，HR-HPV感染宿主细胞后，诱导细胞发生一系列分子表达和功能的改变，继而发生形态学改变。因此，人们设想通过对这些分子变化的检测来帮助筛查子宫颈癌，从而更有效地提高癌前病变的检出率，避免不必要的阴道镜转诊。随着研究的深入，已发现有一些生物标志物与子宫颈癌的发生、发展密切相关，为进一步的临床应用打下了基础。本文就目前的相关研究进展作一综述。

1 P16INK4A蛋白

P16蛋白属于细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI），由染色体9p21上CDKN2A基因编码。P16通过竞争性结合细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）对细胞周期起负向调节作用[2]。在子宫颈癌病变过程中，HPV感染宿主细胞后整合至宿主细胞DNA导致病毒癌基因E6和E7的持续高表达，继而使P16蛋白呈现过度表达的状态。大量研究证明，P16的阳性率随子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）级别的增高而增高，且与CIN进展的危险性相关[3]，提示P16蛋白作为生物标记物分流CIN的可能性。

美国病理学会（CAP）和美国阴道镜与宫颈病理学会（ASCCP）在2012年共同发布的下生殖道鳞状上皮病变术语（LAST）中，建议将P16免疫组化染色用于CIN2的分层管理，P16阳性的处理同CIN3，阴性的可以随访，且当P16阳性有连续大块状深棕色染色时，提示高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL）可能性大[4]。Clinton 等[5]通过回顾性研究发现应用LAST指南后，P16的使用率从2.8%提高到6.2%，HSIL阳性预测值从48%提高到76%。目前普遍认为P16联合HE染色能提高病理医师诊断CIN2+的一致性[2]。然而，Pacchiarotti等[6]研究认为P16对组织学诊断的重复性几乎不产生影响。

此外，HPV阳性且P16阳性女性需要立即转诊阴道镜，若阴道镜检查为阴性，应每年随访；而HPV阳性但P16阴性女性可以不用行阴道镜检查，2～3年随访一次。针对HPV阴性但组织学诊断为CIN2～3的女性，若同时P16阴性，HSIL的诊断应更为慎重[7]。Pabuccu等[8]通过研究认为P16或许能够作为分流非典型鳞状上皮-不除外高度病变（atypical squamous cell cannot ex－clude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASCH）的一个有效手段。

然而在P16的实际临床应用中，还存在着一些问题。尽管大多数P16染色结果是明确的阳性或者阴性，仍有一部分结果是模棱两可的，即仅满足部分阳性的条件。这些模棱两可的P16免疫反应结果是否能作为感染致癌性HPV或判断病灶进展危险性的依据仍有待研究。Liu等[9]研究认为在预测致癌性HPV感染和HSIL的发生上，模棱两可的P16结果弱于阳性结果，但比阴性结果强。Clark等[10]通过对262例女性的宫颈活检结果进行研究，发现其中有50例过度诊断为HSIL，原因可能是当P16染色图案为非块状时，将这样的病例归为HSIL，或将P16免疫组化法应用于病理诊断为LSIL的女性，提示除了对结果判读模糊不定外，可能还存在着P16过度使用的问题。为了更准确有效地应用P16，需要对P16结果进行标准化，即能对染色结果模糊不定的情况做出准确的判断，并且需要对LAST指南进行相应的补充，避免因为判断失误导致错诊或漏诊。

2 P16/ki-67

抗原Ki-67是一种核蛋白，它在除了G0以外的细胞周期中均有表达。在正常生理情况下，ki-67在子宫颈鳞状上皮细胞基层的表达是有限的，ki-67的过表达意味着细胞处于增殖期。P16/ki67在正常子宫颈鳞状上皮细胞中互相拮抗，两者共表达意味着细胞周期发生异常[11]。P16/Ki-67双染细胞学检测CIN2+和巴氏涂片检查相比有更高的灵敏度，与HPV检查相比有更高的特异度[12]，提示其作为CIN2+筛查手段的可能性。

研究发现，在宫颈细胞学异常人群中，P16/ki-67双染细胞学检查与HPV DNA检测相比有更好的分流能力[13]，且费用效能比更高[14]。而双染细胞学与巴氏细胞学相比分流HPV阳性女性的特异度稍低，但灵敏度更高[15]。

虽然P16/ki-67双染检查能显著提高诊断准确性，然而在低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）和意义不明确的非典型鳞状上皮（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）人群中进行危险分层的结果却不尽如人意，尤其是在长期的临床观察过程中[13]。Ziemke等[16]推测可能与生物学因素有关，如年龄、阈值、重复性等，于是对1 141例女性在宫颈细胞学检查时同时行P16/ki-67免疫组化染色（IHC），通过平均19个月的随访发现，＜30岁的女性检测出CIN2/HSIL的特异度小于＞30岁的女性；以10个P16/ki-67标记细胞作为阳性标准比1个有更高的特异度；有28.4%的结果与第一次试验结果不相符。提示P16/ki-67要进行有效应用还需要在具体检测方法上加以规范。

3 DNA甲基化标记物

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基加到胞嘧啶的5号碳原子上。大多数的甲基化发生在CpG岛二核苷酸，常位于启动子区域。抑癌基因（tumor suppressor genes，TSG）启动子区甲基化导致抑癌基因失活是子宫颈癌发生、发展过程中的一个重要机制[17]。

目前已有大量待测基因甲基化研究，但是准确度不够理想。联合多种甲基化生物标志物，从而达到较高的灵敏度和特异度是目前的研究趋势。此外，甲基化标志物检测能够提供客观、非形态学的结果，能够采用自我采样样本进行检测，联合现有筛查方法能够大大提高筛查效率，未来仍需要大样本前瞻性临床试验来对研究结果进行进一步验证。

3.1 配对盒基因 1（PAX1） Kan等[18]研究结果显示PAX1基因甲基化水平检测CIN3+病灶的灵敏度和特异度分别达到了86%和85%，联合巴氏涂片检查灵敏度和特异度为89%和83%，不必要的阴道镜转诊能减少至少60%。Li等[19]和Wang[20]分别比较了HC2 HPV检测和MS-HRM法检测PAX1基因甲基化在ASCUS和ASC-H中分流出CIN2+的能力，结果显示后者检测能力更强。此外，Nikolaidis等[21]对7项研究行Meta分析显示，PAX1基因的甲基化检测更高级别宫颈病变的特异度比HPV DNA检测更高。

3.2 细胞黏附分子1（CADM1）和T淋巴细胞成熟相关蛋白（MAL） Verhoef等[22]对364例HPV阳性女性宫颈刮片进行了RCT研究，结果显示双标志物CADM1/MAL甲基化分流CIN2+的能力与细胞学检查相似，甲基化水平随着病灶严重程度的增加而增加，且两者联合能提高灵敏度，虽然特异度降低，但53.6%的阴道镜检查率仍在接受范围内。已有研究认为宫颈刮片中CADM1/MAL基因甲基化水平还和高危HPV的持续感染相关，高危HPV感染持续＞5年的高级别CIN与感染持续＜5年的相比，明显有更高的CADM1/MAL基因甲基化水平。提示双标志物检测能够分流出长期存在的更晚期的高级别CIN病灶。van Baars等[23]进一步研究了在多种HPV持续感染或多种级别病灶同时存在的宫颈中CADM1/MAL基因甲基化水平，发现其是病灶特异性的，且宫颈刮片中甲基化水平往往代表着最差病灶的水平。

3.3 双标志物MAL/miR-124-2 双标记物MAL/miR-124-2的检测能够通过自采样样本进行，但其灵敏度同细胞学检测相似，仅仅依靠前者进行分流也会导致不必要的阴道镜检查，故Verhoef等[24]希望通过研究提高MAL/miR-124-2甲基化分析的特异度。通过对1 019例自采样为高危HPV阳性女性的RCT临床试验结果显示，MAL/miR-124-2甲基化分析（阈值-80）或联合HPV16/18基因型检测能达到比较高的CIN3+检出灵敏度和特异度。

4 HPV L1蛋白

HPV属于乳头瘤病毒科,由DNA核心和蛋白衣壳组成，而衣壳由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。研究表明，HPV-L1阴性提示癌前病变可能性大，HPV-L1阳性提示一过性感染可能性大，且HPV L1随着CIN级别增高而减少，在子宫颈癌中呈阴性[25]。Lee等[26]进一步研究发现HPVL1阳性但组织学CIN3+的病例可能是多种HPV感染导致的。此外，Mehlhorn等[27]研究发现HPV特异性免疫能力与LSIL的临床缓解有显著关联，L1抗原和HPV16-L1抗体同时阳性的女性，发展为CIN3的危险性很低（5.8%）。利用HPV L1蛋白与CIN的关系，后续需要进一步研究其在子宫颈癌筛查中的效用。

5 microRNAs

近年来已有研究表明miRNA在子宫颈癌及癌前病变组织中呈现或上调或下调的现象，提示其作为子宫颈癌早期筛查标志物的可能性[28]。其中，miR-29a和miR-21分别是上调及下调最频繁的[29]。

Kong等[30]研究发现hsa-mir-92a血浆水平随着宫颈病变程度增高而显著升高，对子宫颈癌及癌前病变诊断的灵敏度和特异度达到69.6%和80.4%，AUC为0.83。另有学者对 4 种 miRNAs（miR-9，miR-10a，miR-20a和miR-196a）进行研究得到类似的结论，且血浆miR-196a水平与CIN级别和子宫颈癌的大小，淋巴转移，FIGO分期和分级有关，水平较高的患者总体生存率较低，提示miR-196a可能是一个早期检测和预后判断的生物标记物[31-32]。

在HPV阳性女性宫颈脱落细胞中，Tian等[33]发现与宫颈细胞学检查相比，单独的miR-424、miR-375，以及miR-424/miR-375/miR-218多标记物联合筛查高级别CIN的方式更佳。此外，Zhu等[34]研究发现，随着宫颈病变程度上升，MiR-21-5p上升、miR-34a下降，区分LSIL和HSIL的能力与HPV检测相比更具有特异性。Coimbra等[35]认为ΔNp63 mRNA和miR-203是有效的子宫颈癌筛查标志物，且两者间可能存在某种间接通路。

综上，miRNAs能够在血浆水平、子宫颈脱落细胞中进行检测，对miRNAs作用机制的研究有助于对子宫颈癌病变的理解，提高对HPV阳性女性的分流效能。

6 细胞角蛋白（cytokeratin，CK）

细胞角蛋白属于细胞质骨架蛋白中间丝的一种，上皮组织恶变后表达的细胞角蛋白与正常组织基本相同，因此细胞角蛋白被广泛用于肿瘤的诊断。子宫颈鳞癌表达 CK5、CK6、CK7、CK8、CK13、CK15、CK17、CK18、CK19。

在子宫颈癌中，CIN2-3从鳞柱交界部（squamocolumnar junction，SCJ）细胞中形成，而 CK7 IHC 能够分辨出SCJ[36]。Mills等[36]在四价HPV疫苗临床试验安慰剂组的CIN1女性中进行CK7 IHC，结果分为阴性，斑驳的，有层次的，或全厚的图案。结果显示全厚的CK7染色与CIN2+的进展有最高的相关性。Paquette等[37]则将CK7 IHC结果分为阳性（弥漫性的）和阴性，结果显示阳性CK7的LSIL更易发展为HSIL。然而由于危险性增加幅度低，差异性小和阴道镜取材的限制，CK7的临床应用仍有待商榷。

Escobar-Hoyos等[38]研究证实从正常宫颈组织，LSIL，HSIL至宫颈癌细胞中，角蛋白17的表达上升，而角蛋白4的表达下降。角蛋白17的表达可以从LSIL患者与健康个体中分流出HSIL与鳞状细胞癌患者，具有较高的灵敏度和特异度（分别为94%和86%），认为其是一个有效的子宫颈癌前病变筛查的生物标志物。

7 小结

筛查子宫颈癌前病变对于早期治疗和预防子宫颈癌具有重要价值，寻找到一种或数种适宜的生物标志物，优化现有的筛查方法从而提高诊断的特异度和灵敏度，是目前的研究方向。尽管上述提到的生物标志物在子宫颈癌病变不同阶段有特异性的表达，能够分辨出高级别宫颈上皮内病变，但要达到临床应用的要求，仍需要前瞻性的临床试验来进一步验证和完善。