以兴奋性毒性机制为靶点的神经保护策略研究进展

刘玉玉综述，王 强审校

兴奋性毒性是最早发现并被广泛认可的脑缺血卒中后损伤的分子机制之一，当大脑处于缺血缺氧状态，由于代谢障碍，导致兴奋性神经递质释放增加与重摄取出现障碍，最终导致大脑缺血区域兴奋性神经递质的水平迅速升高[1]。随后谷氨酸受体的激活导致钙内流和神经元去极化，进而导致大脑中许多钙依赖通路的异常激活和坏死、凋亡和自噬过程的启动[2]。研究表明由谷氨酸介导的兴奋性毒性是导致缺血性脑卒中、癫痫、阿尔茨海默病、精神疾病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化病等神经系统疾病神经元损伤的重要作用机制[3]。自上世纪50年代兴奋性毒性的概念提出以来，关于谷氨酸释放、转运体功能改变、受体表达及其引起的下游细胞死亡信号的激活等已成为脑缺血损伤机制的研究重点。本文综述了近几十年以兴奋性毒性机制中的重要环节为靶点的神经保护策略，并对新一代兴奋性毒性抑制剂如何在上一代药物失败的情况下获得成功进行分析，以期为兴奋性毒性机制的研究和神经保护药物的研发提供帮助。

1 谷氨酸受体及病理激活机制

中枢神经系统的谷氨酸受体包括离子依赖型和代谢型，根据选择性激动剂，离子型谷氨酸受体可分为NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体、AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)受体及KA(海人藻酸)受体[4]。代谢性谷氨酸受体主要是与G蛋白耦联的受体。其中NMDA受体在缺血性脑损伤的发生机制中占据主要地位，是神经保护类药物研发的重要靶点。

离子依赖型谷氨酸受体是配体门控通道中最具代表性的一类受体，它们具有细胞外谷氨酸结合位点和跨膜离子通道[5]。在静息状态下，NMDARs的通道空隙通常被Mg2+阻断。当谷氨酸从突触前膜释放后，激活的AMPAR导致突触后膜的部分去极化，其足以清除阻滞在NMDAR离子通道中Mg2+，一旦NMDAR被激活，离子通道打开，细胞外的Na+和Ca2+内流入细胞[6]。在兴奋性毒性中，过量释放的谷氨酸导致NMDARs过度激活，Ca2+内流增加，致使神经元内钙超载。钙超载可触发一系列下游促死亡信号事件，如钙蛋白酶激活、活性氧生成、线粒体损伤等，致使细胞坏死或凋亡[7]。

2 靶向NMDAR的药物研究进展

鉴于NMDAR在兴奋性毒性的重要作用，最初的治疗策略主要是阻断受体。NMDAR上有许多药理学上可以利用的位点，包括离子通道孔、谷氨酸结合位点、甘氨酸结合位点等，NMDA受体拮抗剂主要通过靶向上述位点发挥神经保护作用。

根据药物作用靶点的差异，谷氨酸受体拮抗剂可分成竞争性和非竞争性受体拮抗剂。非竞争性拮抗剂主要在通道空隙水平阻断NMDAR，从而减少钙的流入。盐酸瑞马西胺、盐酸阿替加奈、MK-801(dizolcipine)、美金刚、dextromethorphan、及其代谢物dextrorphan等是近年来研发的非竞争性NMDA受体拮抗剂，它们在体外培养的神经细胞实验和动物实验中都显示出神经保护作用，但遗憾的是，在随后的临床试验中，除美金刚外其他的药物均未展现出神经保护作用。竞争性受体拮抗剂通过竞争性结合谷氨酸结合位点来抑制受体的过度激活。当前研发的竞争性NMDA受体拮抗剂主要有赛福太和D-CPP-ene，研究表明这两种药物均可减轻神经元损伤和降低梗死体积，但接下来的两项Ⅲ期临床试验显示与对照组相比，实验组的死亡率增加，因此这两种药物在临床也被暂停使用。

研究表明NMDAR需要甘氨酸(协同激动剂)协同激活[5]。在协同激动剂和激动剂都与受体上的位点结合后，选择性阳离子通道打开，阳离子内流(尤其是Na+、Ca2+、K+)[5]。甘氨酸位点竞争性拮抗剂Gavestinel和Licostinel，通过竞争性结合甘氨酸结合位点，来抑制NMDA受体激活，与直接阻断NMDA受体的药物相比，Gavestinel和Licostinel的不良反应更少。研究发现与许多NMDA受体拮抗剂相比，Licostinel可能是一种更安全、更耐受的神经保护剂。但遗憾的是，诺华公司在发现一些患者的尿液中含有可能有害的Licostinel晶体后推迟了进一步的研究。2005年，CoCensys终止了Licostinel的研发。Sacco等开展的多中心GAIN试验显示在急性缺血性卒中后6 h内使用gavestinel，与安慰剂组对比，实验组在3个月时神经功能没有改善，在后续的数据分析中，梗死面积(MRI)也无明显差异[8]。

3 靶向NMDAR亚基的药物研究

最近的研究表明NMDA受体在神经元的存活和死亡中具有双重作用，NMDARs的正常激活在突触可塑性、大脑发育、学习和记忆等方面发挥重要作用，然而，当NMDARs在病理状态下被过度激活时，会引发神经毒性级联反应，导致神经元死亡[9]。NMDA 受体拮抗剂在治疗剂量下，除抑制受体的异常激活，受体正常的生理活动也会受到影响，导致严重的副作用，如恶心、呕吐、心血管和精神方面的影响等。因此，选择性抑制受体过度激活而保留正常的受体活动成为药物研究的新目标。

NMDAR由两个GluN1亚基和两个GluN2亚基构成的异质四聚体。两个GluN1亚基构成了离子通道的主体结构，NMDARs的主要特性由其决定，GluN2亚基在NMDAR功能中主要起调节NMDAR离子通道的作用[10]。GluN2亚基可以是GluN2A-GluN2D，也可以是GluN3A和GluN3B[11]。不同亚基构成的NMDAR具有不同的作用，在脑内的分布部位也有很大差异。最近的研究表明，NMDARs在神经元存活和死亡中的双重作用可能取决于受体的亚细胞位置和亚型。在受体位置假说中，刺激突触的NMDARs激活促生存信号通路，而突触外NMDARs的激活与促死亡信号通路相关[12]。已证实GluN2A亚基主要存在于突触内，是谷氨酸介导的神经元存活所必须的，而突触外位点则富含GluN2B受体，被认为会导致兴奋性毒性和细胞死亡。近年来，研发了选择性抑制GluN2B的药物，如艾芬地尔及其衍生物依利罗地(eliprodil)(SL-82.0715)和曲索罗地( traxoprodil) (CP-101,606)，这些药物没有传统NMDAR拮抗剂的副作用。然而这些药物用于临床的有效性与安全性仍需更多的研究来证实。

4 干预NMDAR的下游死亡信号通路的治疗策略

由不同的亚基组成的NMDARs在突触与突触外的分离并不是绝对的，因此选择性抑制突触外的含GluN2B的NMDARs仍有可能拮抗突触含GluN2A的NMDARs。近年来，研究人员建议将NMDAR的下游死亡信号通路作为研究目标，而不再局限于受体本身。这种方法主要针对下游的死亡信号通路而对NMDARs介导的正常生理过程没有影响。

GluN2B-PSD95-nNOS通路是在与膜结合的NMDARs相关的多蛋白复合物中发现的一种特征明显的神经元死亡信号通路[6]。PSD95(突触后蛋白密度为95KDa的支架蛋白)为NMDARs和包括nNOS(一氧化氮合酶)在内的下游分子提供了一种结构性连接[13]。当NMDARs被过度激活时，内流的Ca2+通过钙调蛋白激活nNOS，从而产生过量的NO(一氧化氮)，NO是一种活性氮，能与自由基超氧化物相互作用形成过氧亚硝酸盐，这是一种可导致蛋白质硝化和氧化、脂质过氧化和直接DNA损伤的强氧化剂，过量产生的NO最终可导致细胞死亡[14]。破坏GluN2B-PSD95-nNOS复合物可以抑制NMDA介导的NO的生成，保护神经元。抑制NO产生的一种方法是使用结合PSD95或nNOS的干扰肽，最近研发的被称为Tat-NR2B9c或NA-1的干扰肽可将NMDARs与PSD95分离，并减弱下游神经毒性信号[15]。在大鼠体内进行的研究表明，在缺血性卒中后给于NA-1可减少梗死面积，改善神经行为功能[16]。一项在加拿大和美国14家医院进行的,用于评估NA-1用于人类缺血性脑损伤疗效的一项双盲、随机、对照研究表明与对照组相比，NA-1治疗组降低了梗死体积，且具有更好的预后效果[17]。最近研究发现，ZL006和IC87201也可干扰GluN2B-PSD95-nNOS通路来发挥神经保护作用，然而它们在临床使用的疗效和安全性仍有待进一步研究来证明。

抗氧化剂通过抑制NO介导的氧化和硝化应激也可发挥神经保护作用，传统的抗氧化剂，如依达拉奉、胞磷胆碱、替扎拉特等在多项临床试验的荟萃分析中均显示出神经保护的效果。同时研究还发现尿酸、褪黑素、EPO等非传统抗氧化剂在多项临床研究中也表现出神经保护作用，但还需更多研究来证明其疗效与安全性。

DAPK1(死亡相关蛋白激酶1)是一种依赖于Ca2+/钙调蛋白的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其活性与细胞凋亡有关[18]。在正常状况下，DAPK1的活性被自身磷酸化抑制，当与Ca2+结合激活CaM后，DAPK1的抑制被解除，表现出促凋亡的活性[19]。在缺血性脑卒中中，过多的Ca2+流入细胞，激活CaM和钙调神经磷酸酶(CaN),进而使DAPK1脱磷和活化[20]。研究表明，活化的DAPK1在缺血损伤后被招募到NMDARs的GluN2B亚基[21]。最近研发的使DAPK1与GluN2B亚基解耦的干扰肽Tat-GluN2BCT1292-1304，在活体实验中被证实具有神经保护作用，但其作用机制与疗效仍需更多的实验来证明[6]。肿瘤抑制因子P53是DAPK1的一种底物，是一种转录调节剂，控制缺血性卒中和神经退行性疾病的细胞死亡途径。一种干扰P53与DAPK1相互作用的干扰肽Tat-P53DM241-281已被Wang等证明在MACO后6 h给予可减少梗死体积，改善神经行为[22]。

此外基于更下游死亡信号蛋白的研究，如Calpains(钙激活酶)、MAPKs(丝裂原活化蛋白激酶)、SREBP1(固醇调节元件结合蛋白)等也研发出一些药物，这些药物在体外和动物试验中都展示出神经保护作用。

5 干预谷氨酸释放和重摄取的治疗策略

除了干预NMDARs的下游死亡信号通路，干预谷氨酸释放和重摄取也是最近科学家研究的较多的神经保护治疗策略，这种治疗策略从源头解决NMDARs的过度激活，在一些研究中已经表现神经保护的潜能。

正常情况下，释放到突触间隙的谷氨酸会被谷氨酸转运体迅速清除，以保持突触中谷氨酸平衡。在脑缺血、缺氧等的病理情况下，ATP的产生和利用出现障碍，导致Na+/K+ATP酶功能障碍，K+在胞外堆积，使细胞去极化，Na+浓度梯度被破坏，转运体无法摄取胞外谷氨酸[23]，最终导致突出间隙谷氨酸过度堆积，产生兴奋性毒性作用。

谷氨酸转运体(EAAT)有5种类型(EAAT1-EAAT5)，其中EAAT2负责脑内大部分谷氨酸的清除，增强EAAT2活性或其在神经元和胶质细胞膜上表达可能为抑制兴奋性毒性提供一种新的治疗方法[24]。研究发现，头孢曲松能增加肌萎缩侧索硬化症小鼠模型中的EAAT2活性[25]，目前正在进行这方面的临床研究。此外有报道称，具有复杂作用机制的利鲁唑也能提高谷氨酸转运体的活性[26]，但目前还没有针对卒中或者创伤性脑损伤等的临床试验。

研究表明，在大脑和血液之间创造一个更大的谷氨酸浓度梯度，可以提高谷氨酸从大脑流向血液的速度。因而使用血液谷氨酸清除剂，也可能具备潜在的神经保护作用。谷氨酸清除剂如草酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶已被证明可以降低血液中谷氨酸浓度，从而增加大脑对谷氨酸外排的驱动力，进而降低大脑谷氨酸水平[27]。

6 思考及展望

尽管过去几十年来以兴奋性毒性机制为靶点的药物研发成指数式增长，但目前临床上推荐用于卒中和多种神经退行性疾病的神经保护药物屈指可数。这背后涉及多方面的原因，既有动物实验向临床试验转移的失败，也有药物严重的不良反应导致的药物研发的终止。但令人兴奋的是，随着分子生物学和药理学进展，我们对NMDA受体及其下游死亡信号通路和谷氨酸的清除机制有了更深的了解，针对这些新的治疗靶点研发的药物与传统的NMDA受体拮抗剂相比，具有广泛的治疗时间窗和更少的不良反应。然而针对这些新靶点的药物多停留在动物实验阶段，其临床有效性与安全性还需临床试验来验证。

有研究指出兴奋性毒性可通过多条死亡通路和多个靶点导致神经元死亡，因此只针对单一靶点的药物可能疗效不佳，同时联合针对多个靶点的药物可能具有协同作用，因此针对多个靶点的神经保护药物也是未来研发的重要方向。