苦参对耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 细胞上皮间质转化及吉非替尼药物敏感性的影响

沈云飞 詹建伟

肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的75%～80%，5 年生存率低于50%，表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺腺癌患者占有较大比例，目前靶向药物治疗被推荐作为一线治疗[1]。靶向药物的广泛应用，导致癌细胞对靶向药物耐药而严重影响疗效，也是治疗失败的主要原因[2]。如何增加肺癌细胞对靶向药物的敏感性、揭示其耐药机制，是目前国内外研究的热点与难点[3]。本实验采用体外苦参作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 细胞，分别通过MTT 法、流式细胞术、侵袭实验检测经苦参干预的耐药细胞株对吉非替尼药物敏感性和侵袭转移能力的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞株 人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 细胞株由浙江大学医学院提供。

1.2 主要试剂和材料 吉非替尼（AstraZeneca UK Limited，规格：0.25g/片，批号KK429）；复方苦参注射液（山西振东制药股份有限公司，规格：5mL/支，批号990809）；磷酸盐缓冲溶液（批号YM-S1065）及胰酶（批号185204）由杭州吉诺生物医药技术有限公司提供；胎牛血清（批号10099-141）及DMEM 培养基（批号SH30023.01B）由北京毕特博生物技术有限责任公司提供；β-Actin 抗体（批号SC-8007）、山羊抗兔IgG 二抗（批号SC-5123）、甲基偶氮唑蓝（MTT）（批号185041）由杭州联科生物技术股份有限公司提供。

1.3 方 法

1.3.1 常规细胞培养 将处于对数生长期人肺腺癌耐吉非替尼PC9/ZD 细胞株接种至5cm×5cm 大小的培养瓶，在37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶80%进行传代并进行下一步实验，传代时将部分细胞冻存至液氮罐中，解冻后细胞状态正常。

1.3.2 MTT 法检测细胞抑制率 将对数期生长的耐吉非替尼PC9/ZD 细胞株消化离心后铺板在96 孔板内，细胞浓度为（3～5）×104/mL，每孔100μL 细胞悬液，将细胞分为对照组（不含药物培养液）、吉非替尼组（吉非替尼0.5、2、8、32μg/mL），每个浓度梯度设置3 个复孔，边缘孔用无菌PBS 填充。培养24h 后进行MTT 试验，酶标仪波长为490nm，测OD 值，观察细胞的生存状态从而得出IC50。根据MTT 结果筛选出最接近IC50 的吉非替尼浓度8μg/mL 与苦参进行联合，将细胞分为对照组（不含药物培养液）、吉非替尼组（8μg/mL）和苦参联合吉非替尼组（0.5mg/mL 苦参+8μg/mL 吉非替尼）进行MTT 试验。苦参浓度选择依据：当苦参浓度为0.5mg/mL 时24h 细胞生长抑制率小于10%，因此可视为无细胞毒性的苦参浓度。

1.3.3 Western blot 检测相关蛋白表达 将耐吉非替尼PC9/ZD 细胞悬液传代至5cm×5cm 大小的培养瓶，对照组（不加药物），吉非替尼组（8μg/mL），苦参联合吉非替尼组（0.5mg/mL 苦参+8μg/mL 吉非替尼）培养24h，细胞长到对数生长期，采取RIPA 裂解法提取蛋白，选用BSA 母液测量蛋白浓度，后计算上样量跑电泳，PVDF 膜进行转膜，室温脱脂奶粉进行封闭，一抗孵育2h，PBST 洗脱3 次，二抗孵育2h，PBST 洗脱3 次，ECL 化学发光显色。

1.3.4 Transwell 实验检测细胞侵袭能力 将对数期生长的耐吉非替尼PC9/ZD 细胞株消化离心后，细胞浓度为5×104/mL，对照组（不加药物），吉非替尼组（8μg/mL），苦参联合吉非替尼组（0.5mg/mL 苦参+8μg/mL 吉非替尼）。将60μL 的DEME 培养基稀释6倍的Matrgel 胶加入transwell 小室中，后在transwell上下室中分别加入200μL 细胞悬液和含500μL 10%FBS 培养基，设置3 个复孔，培养24h 弃液，并用滤纸吸干，4%多聚甲醛常温固定15min，0.1%结晶紫染色液染色20min，烤箱烤干后计数观察，每个小室随机抽取5 个视野。

1.3.5 流式细胞术测量细胞凋亡 对照组（不加药物），吉非替尼组（8μg/mL），苦参联合吉非替尼组（0.5mg/mL 苦参+8μg/mL 吉非替尼）培养24h 后，将单细胞悬液加入离心管中，1500rpm，离心5min 弃上清，加入PBS 洗涤离心弃上清，加入预冷PFA，4°C固定30min，离心弃上清，PBS 洗涤离心弃上清，加PI室温避光孵育30min，混匀，上机检测。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行分析与处理数据，计量资料采用均数±标准差表示，三组间比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验；计数资料采用百分比（%）表示，采用χ2检验，P<0.05 提示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 苦参对吉非替尼诱导的人肺腺癌PC9/ZD 细胞增殖抑制的影响 吉非替尼组人肺腺癌PC9/ZD 细胞增殖抑制率（33.46±0.84）%，苦参联合吉非替尼组细胞增殖抑制率（74.59±3.21）%，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 苦参对吉非替尼诱导的人肺腺癌PC9/ZD 细胞EMT 相关蛋白表达的影响 在苦参作用下，吉非替尼诱导的人肺腺癌PC9/ZD 细胞波形蛋白及N 钙黏蛋白表达下调，E 钙黏附分子表达上调，见插页图1。

2.3 苦参可增强吉非替尼对人肺腺癌PC9/ZD 细胞的侵袭抑制能力 对照组、吉非替尼组及苦参联合吉非替尼组人肺腺癌PC9/ZD 细胞侵袭率分别为（91.03±11.02）%、（64.23±8.04）%、（48.59±7.26）%，组间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05），见插页图2。

2.4 苦参可增强吉非替尼诱导的人肺腺癌PC9/ZD细胞凋亡 对照组人肺腺癌PC9/ZD 细胞凋亡率（31.14±5.26）%；吉非替尼组细胞凋亡率（56.48±8.77）%，当吉非替尼浓度不变时，联合使用苦参组细胞凋亡率（76.25±10.28）%，组间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05），见插页图3。

3 讨 论

肿瘤细胞发生耐药的原因相当复杂，包括耐药基因异常表达，DNA 损伤修复及抑制细胞凋亡等途径。苦参的主要活性成分为苦参碱，有报道显示，其可通过抑制细胞增殖，诱导凋亡克服肿瘤的多药耐药现象[4-6]。但是目前，苦参对吉非替尼诱导的人肺腺癌PC9/ZD 细胞株耐药情况尚不明确。本研究结果显示，当苦参浓度为0.5mg/mL 时，可显著增强吉非替尼诱导的PC9/ZD 细胞增殖抑制和凋亡敏感性。提示苦参可调控肺癌细胞的吉非替尼药物敏感性。但是其作用机制仍需进一步研究。

肿瘤细胞的多种生物学过程改变均会导致细胞内上皮间质转换（EMT）的异常改变，进而改变细胞的生物学行为[7]。EMT 以上皮标志物蛋白（E-钙黏蛋白、EpCAM 等）的下调及间叶标志物蛋白（如波形蛋白、纤连蛋白等）的上调为主要特征，与肿瘤多药耐药密切相关[8-11]。EMT 现象最早在晶状体细胞中发现[12]，其在肺癌的侵袭转移和细胞细胞耐药过程中扮演着重要角色[13-15]。Shintani 等[16]研究发现，在非小细胞肺癌组织中，EMT 是造成肺癌细胞对紫杉醇和顺铂产生耐药的主要原因；Su 等[17]对吉非替尼耐药的细胞研究发现，细胞表现出显著的E-cad 表达下调的EMT 特征；通过对比非小细胞肺癌发生EMT的程度与癌细胞对酪氨酸激酶抑制剂类（TKIs）药物的敏感性相关度发现，EMT 程度低得癌细胞对TKIs类药物的敏感性显著高于EMT 程度高的癌细胞[18]。提示EMT 可能是TKI 类药物产生耐药的重要因素之一。本研究结果显示，苦参作用可以显著增强吉非替尼诱导的PC9/ZD 细胞波形蛋白、N 钙黏附蛋白表达下调，E 钙黏蛋白表达上调，增强吉非替尼对细胞侵袭能力的抑制。提示在耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD 细胞中，苦参对吉非替尼药物敏感性的影响可能是通过调控EMT 过程实现的。

综上所述，苦参能改善耐吉非替尼细胞对吉非替尼的敏感性，可能通过逆转EMT 过程改善肿瘤细胞生物学过程，但是苦参逆转上皮间质化过程的具体机制仍需进一步研究。