促进原位内皮化——冠状动脉支架生物活性涂层的研究进展

张明 赵卓 张建奇 吴熙 张基昌

心血管疾病尤其是心肌梗死是全球临床死亡的主要原因之一。在过去的几十年中，冠状动脉支架置入术使全世界许多患者受益。然而，目前血管支架存在一定的缺点，尤其是内皮化受损导致支架内血栓形成和新生内膜过度增生。原位内皮化是解决再狭窄及支架内晚期血栓形成最具前景的研究方向。

原位内皮化是指在冠状动脉支架置入术后，促进功能性内皮直接再生于支架表面。早期方法主要是吸引支架与血管接触部位的内皮细胞（endothelial cells，ECs），但是较低的ECs迁移率阻碍了这种方法实施。最近，捕获内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的想法引起了极大关注。EPCs主要来自骨髓外周血中的循环单核细胞，并且能够分化为成熟的ECs。最近的研究证实了EPCs在血管修复和重塑中的关键作用，其具有在体内产生功能性内皮的能力［1］。已有大量研究策略来增强生物材料的原位内皮化，本文将简要总结一些主要策略，重点介绍一些最近的研究。

1 刺激性生物活性分子

一些生长因子或生物小分子能够刺激ECs的生长。虽然这些生物分子通过各种生化途径影响许多靶组织，但体内和体外研究都已经表明它们具有加速内皮化的能力，简述如下。

1.1 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF以其在血管发育中的作用而得名，是细胞产生的一种信号蛋白，并且是ECs的重要调节分子，能够促进血管生成和分化。有研究发现，表面固定的VEGF能够通过增加ECs黏附、增殖和迁移来促进内皮化。VEGF也促进了EPCs向ECs系的分化［2］。有趣的是，VEGF还可以作为趋化生物分子，通过靶向VEGF R1和VEGF R2受体促进EPCs捕获［3］。捕获后，VEGF可诱导分化并支持ECs功能［4］。基于这些研究，Takabatake等［5］开发了一种VEGF涂层的EPCs捕获支架，并进一步说明它在减少新生血管内膜增生方面相比于抗-CD34抗体支架更具有特异性和有效性。由于VEGF能够促进ECs的黏附和增殖，将其作为生物活性涂层固定在支架表面有望促进支架置入后的内皮化进程。但需要注意的是，VEGF的突释可能导致肿瘤发生，因此VEGF安全地应用于原位内皮化需要被严格评估。

1.2 一氧化氮（nitric oxide，NO）

NO最近在心血管领域引起极大关注。NO能够调节血栓形成，促进ECs增殖，并在心血管系统中发挥保护作用。值得关注的是，NO在抑制血小板激活和聚集、调节血管平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMCs）增生和血管舒张方面也起到重要作用。Major等［6］报道了存在NO释放的聚合物涂层能显著减小血小板激活和血栓形成。Kushwaha等［7］发现被释放或催化产生的NO不仅能显著减少血小板的活化聚集，而且还能抑制SMCs增生。由于NO在体内半衰期短，因此许多研究都将目标瞄准NO供体。Yang等［8］选取了具有仿生NO催化活性酶（谷胱甘肽过氧化物酶）功能分子硒代胱胺（SeCA）作为支架涂层制备前驱体，成功在支架表面构建具有可调控NO催化释放功能的黏附涂层，实验表明这种涂层选择性促进ECs生长，显著抑制了支架内再狭窄。

1.3 肝素

肝素以其抗凝血作用而闻名，是血管支架和移植物中最常用的药物之一。肝素主要通过与抗凝血酶Ⅲ结合，增强对活化凝血酶和Xa因子的抑制作用而发挥其抗凝作用［9］。另外，肝素还具有抑制SMCs黏附和增殖的作用［10］。因此，在支架表面构建肝素化涂层成为一个研究热点。Yang等［11］在支架表面固定肝素涂层，实验表明其不仅能够增强支架的生物相容性、抑制SMCs增殖，还能促进ECs增殖。这些研究表明功能多样性的肝素在冠状动脉支架方面应用具有广阔的前景。但是，支架涂层表面肝素的含量会对实验结果产生不同影响。Gong等［12］在猪体内置入肝素涂层支架1个月后，表面肝素含量为2.6 μg/cm2实验组的ECs完全覆盖，而6.3 μg/cm2实验组的表面ECs仅部分覆盖。

2 选择性细胞捕获生物活性分子

在生物材料表面固定生物活性分子能够选择性捕获EPCs（或ECs），进而实现原位内皮化。这些生物活性分子包括抗体、多肽和适配子。

2.1 抗体

一般来说，骨髓中的早期EPCs或者迁移到循环血液中不久的EPCs，其表面有3种特异性标志物（CD34、CD133和VEGF R2）。因此，可以利用对早期EPCs表面受体具有特异性的抗体来改进冠状动脉支架，通过捕获EPCs来实现支架置入后快速原位内皮化。抗-CD34抗体是迄今为止用于支架涂层最常用的EPCs捕获生物活性分子。尽管抗-CD34抗体已经在介导EPCs捕获领域得到广泛认可，但抗-CD34抗体的使用并非没有问题。CD34并不完全特异存在于EPCs，它也见于其他类型细胞的表达，如造血干细胞和血小板。因此，研究结果亦表明抗-CD34抗体支架长期抗支架内再狭窄效果不如预期显著［13］。抗-VEGF R2抗体是另一种用于捕获EPCs的抗体，VEGF R2除了在EPCs中的特异性表达，还在分化的ECs中表达，这表明捕获VEGF R2可能比CD34更具有特异性。但目前并没有让人信服的研究比较出抗-VEGF R2抗体与抗-CD34抗体的优劣。另外，VEGF R2也可以在一些巨噬细胞和单核细胞中表达，可能因此刺激产生一些不必要的免疫应答。虽然CD133在EPCs中表达有所下降，但亦有研究应用抗-CD133抗体捕获EPCs。Sedaghat等［14］研究显示抗-CD133抗体支架与裸金属支架相比，在置入体内后再内皮化与新生内皮形成方面比较并无明显优势。

2.2 细胞特异性结合肽

纤维粘连蛋白CS5区的多肽片段精氨酸-谷氨酰氨-天冬氨酸-缬氨酸（REDV）则能特异性识别整合素α4βl，并通过与该受体间的生物识别来介导材料表面ECs的选择性黏附。

相对于抗体而言，多肽结构更为简单，具有更高的稳定性，且不易变性失活。有学者在此领域做了大量深入前沿的研究，证实了REDV活性多肽可选择性吸附ECs，加速内皮化，改善支架表面界面，降低再狭窄［15-16］。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）是与REDV相类似的肽序列。有报道表明ECs对环状RGD（cRGD）的结合亲和力高于链状RGD，这可能是因为cRGD的构象更接近天然配体［17］。类似地，还发现其他黏附蛋白衍生肽序列对ECs黏附和迁移具有显著影响，例如酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）［18］；另一种由噬菌体衍生而来的多肽序列CRRETAWAC对ECs有较好的亲和力，并且对血小板的亲和力较低，有望解决支架内血栓形成及再狭窄的问题［19］。

2.3 细胞特异性适配子

核酸适配子是一条寡核苷酸序列，通过SELEX技术（指数富集配体系统进化技术）以指数富集与靶分子特异结合，经过筛选获得亲合力高、特异性强的寡核苷酸适配子，这些靶子可以是小分子、大分子、甚至是整个细胞［20］。Hoffmann等［21-22］用SELEX技术，筛选出具有对EPCs高特异性的核酸适配子，并对其加工修饰。结果表明，改进后的支架材料能有效地捕获血液中的EPCs，加速内皮化进程。Rotmans等［23］在聚四氟乙烯血管支架上固定核酸适配子后，置入动物体内，第3天和第28天的随访结果显示，实验组的ECs覆盖率较对照组显著提高。值得注意的是，用于EPCs捕获的适配子并未得到广泛研究，其在体内的稳定性及表现需要进一步探索。据报道，有些适配子序列可能导致不良免疫反应［24］。

3 其他方法

磁力用于增强特定部位的原位内皮化。这通常通过用磁性颗粒标记分离的EPCs来完成，例如超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）纳米颗粒或微球，然后使用外部磁场定位在损伤部位［25-26］。然而，这种方法需要分离EPCs，这与原位内皮化的目的相矛盾。尽管目前食品药品监督管理局批准了SPIO纳米粒子的使用，但微粒/纳米粒子标记细胞在体内的长期影响是不确定的［26］。

4 展望

原位内皮化仍然是一个相对较新的概念，不仅意味着实现EPCs的捕获和促进分化，还意味着长期维持ECs的能力。虽然已经探索了许多策略，但未来的研究可能会结合这些策略，模仿ECs生产过程，将捕获的生物分子、生长刺激因子和适宜的基体材料相组合。其他前景可能包括加入特定药物以增强内皮化、抑制血小板或SMCs的聚集，并利用电刺激来吸引或排斥特定细胞。该领域绝对需要新颖的想法，随着不断增加的多学科合作，原位内皮化有望解决目前支架置入后存在的支架内血栓形成、晚期或极晚期支架内再狭窄的问题。