CircRNA:胃癌诊断和治疗的新视角

高慧芹 李露喃 张晨静 屠江锋 耿晓歌 潘文胜*

作者单位:233030 蚌埠医学院(高慧芹)

310014 浙江省人民医院(李露喃 张晨静 屠江锋耿晓歌 潘文胜)

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有癌症中占第四位[1].胃癌是全球癌症死亡的第二大原因.胃癌发病常在特定的区域,被诊断为胃癌的患者中超过一半来自东亚,如日本和中国[2].胃镜检查及病理诊断是胃癌诊断的金标准.然而,其是一种微创技术,其结果依赖于内镜医师的技能和经验.基于血液的生物标志物是非侵入性的,可以提供关于胃癌状态的信息.但是,目前的血清肿瘤标记物,如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原72-4(CA724),在胃癌的诊断阳性率较低.晚期胃癌患者的预后较差,其5年总生存(OS)率不到30%.而对于早期诊治的胃癌患者,90%可以通过切除治愈[3].近年来由于根除幽门螺杆菌知识的提高及随着诊断方法和治疗方法的发展,胃癌的发病率和死亡率持续下降,但早期胃癌仍然难以诊断[1],其仍然严重威胁着人类健康.因此,有必要寻找新的无创性生物标志物用于胃癌的诊断和监测.

"circRNA"是在1976年首次被提出的概念,Sanger等研究类病毒中发现单链共价闭合环状RNA分子(circRNA)可引起某些高等植物致病[4].在20世纪70年代,研究者们曾一度认为circRNA是由于拼接错误产生的[5-6].近年来,随着技术的迅速发展和RNA测序的广泛应用,对circRNA产生了新的认识.环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,也是RNA领域最新的研究热点.与传统的线性RNA不同,circRNA分子是通过反向剪接形成的闭合环状RNA分子,不受RNA外切酶影响,表达更丰富,具有高度稳定性、生物进化保守性和组织表达特异性.数百条circRNA已经被研究认为与肿瘤关系密切,包括肝、肺、大肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾脏、胃肿瘤以及中枢神经系统恶性肿瘤和恶性血液病等.circRNA作为癌症的生物标志物具有较大的潜力.另外,circRNA可在体液中被检测到,如血液、唾液等,表明其可用来作为非侵入性的生物标志物.重要的是,circRNA参与了癌症的发生发展,一些circRNA已表现出明显的抗癌作用.本综述就circRNA的生物学功能及其在胃癌中的作用进行探讨.

1 circRNA的功能

CircRNA有许多潜在的功能,如作为MmicroRNA(miRNA)海绵,结合到RNA结合蛋白形成RNA蛋白质复合物,然后调节基因转录,也可以进行蛋白质翻译等.

1.1 circRNA作为miRNA"海绵"或竞争性内源性RNA miRNA是一类非编码的小RNA,可抑制mRNA翻译所涉及的一系列生物过程.其通过碱基互补直接靶向mRNA.由于"海绵"的结合位点在miRNA上的区域是特异的,这些RNA可以"海绵"某个miRNA的整个家族,因此circRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA),能竞争性结合miRNA,从而调控miRNA靶基因的表达.

2013年,有两项研究为这一想法提供了强有力的证据.cirs-7(circRNA海绵miR-7)也被称为反义转录相关蛋白1小脑变性(cdr1as),其在人类和小鼠的大脑高表达,过表达的cirs-7通过抑制miR-7活性增加miR-7作用靶点的水平[7-8].除了cirs-7,还有睾丸特异性Y染色体上的性别决定区(circ-Sry),其作为miR-138的"海绵",可上调表达miR-138靶基因[7].因此可通过预测miRNA结合位点进而预测circRNA的非编码功能.

1.2 circRNA调控可变剪切或转录过程 环状RNA一般由剪接体产生,因此,circRNA的产生可能调节线性剪接.线性剪接和circRNA的产生通过彼此竞争的剪接位点相互调节.例如,circMbl是由剪切因子MBL的第二个外显子环化而来,竞争mRNA的线性剪切.CircMbl的侧翼外显子和自身序列包含MBL特异性结合的位点.MBL的表达水平受到circMbl的调控影响.研究表明,MBL可通过调整circRNA的形成和线性剪接之间的平衡来影响可变剪接过程,当蛋白质过量时,其通过促进circMbl产生降低自身mRNA的产生.这个circRNA可以通过结合进而对多余的MBL蛋白发挥"海绵作用"[8].另外,circRNA也可以发挥转录调控作用.一些circRNA可定位它们的转录位点,通过未知的机制与RNA聚合酶II复合物结合影响转录.例如,研究发现,内含子和外显子共同形成的circRNA(exonic-intronic circRNA,EIciRNA),如circEIF3J和circPAIP2,可通过与RNA聚合酶II相互作用调节亲本基因转录[9].

1.3 circRNA可翻译成蛋白质 circRNA可以直接翻译成蛋白质.1995年,Chen等[10]发现在一个特定的circRNA起始密码子ATG上游插入一个内部核糖体进入位点(IRES)可以翻译蛋白质.此前已发现一个天然的circRNA可翻译蛋白-HDV,其是乙肝病毒HBV的一个亚型.2017年,Maolei Zhang等[11]研究发现circ-SHPRH编码一种新型蛋白质,其翻译成146个氨基酸的蛋白质,称之为"SHPRH-146aa",并能抑制胶质瘤的发生.

1.4 与RNA结合蛋白相互作用 circRNA可通过与蛋白形成复合体发挥其生物学功能.例如,Foxo3是一个参与癌症发展过程的基因,通过增强Akt的活性或者抑制PTEN的活性而抑制肿瘤发展,circ-foxo3来源于Foxo3基因,其通过桥接细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和p21阻滞细胞从G1期过渡至S期.circ-Foxo3、CDK2、p21形成的三元复合体彼此依赖,可防止CDK2和p21被降解[12].

1.5 抑制核糖体RNA的成熟 对circANRIL的研究发现circRNA的另一个功能是抑制核糖体RNA的成熟[13].通过蛋白质组学分析,circANRIL可与核糖体生成有关的pescadillo斑马鱼同源1(PES1)蛋白结合.circANRIL是通过与rRNA前体分子竞争结合PES1影响核糖体成熟进程.这些研究扩展了我们对circRNA基础分子功能的知识.

2 circRNA在胃癌中的生物学作用

circRNA在人类细胞中广泛表达,与它们的线性异构体相比其表达水平高达10倍以上[14].与其他非编码RNA相比,如miRNA和长链非编码RNA(lncRNA),circRNA的两个最重要的性质是高度保守的序列和在哺乳动物细胞中高度的稳定性[15],这些特性使其成为诊断癌症的潜在生物标志物.miRNA是人类癌症发病机制中的重要成员,而circRNA作为microRNA"海绵"可调节miRNA的活性.因此,circRNA可在肿瘤发生、发展中起中介作用.例如,Li等[16]发现hsa_circ_002059在胃癌组织中显著下调,其表达水平与胃癌远处转移及TNM分期有关.尤其术后胃癌患者血浆样本中的hsa-circ-002059表达水平明显高于术前.hsa_circ_002059稳定存在胃癌患者血浆中,支持其作为一个潜在的生物标志物.另外Jie Chen等[17]发现circpvt1在胃癌组织表达上调,其竞争性结合了miR-125家族的分子,导致胃癌细胞增殖能力提高.这些研究结果表明circRNA表达异常可以作为无创性胃癌诊断和预后评估的生物标志物.

2.1 circRNA可作为诊断胃癌的标志物 众所周知,如果癌症在早期阶段被确诊,大多数类型的癌症是可以治愈的.然而,常用的诊断癌症的标志物和工具具有侵入性且昂贵,如磁共振成像、计算机断层扫描和组织病理学等.因此,临床上迫切需要一种无创、可以早期发现疾病变化的诊断方法.通过近年的研究发现环状circRNA是非常稳定的分子,相比较于线性mRNA、miRNA及其他类型的RNA,在全血、血浆、血小板中更丰富.血液中的circRNA大多数是完整的circRNA,但mRNA和rRNA 是碎片.鉴于其稳定性和细胞特异性,即使被少量释放入血液中,也是可检测的.肿瘤标志物及其联合检测是胃癌筛查的有效方法.在临床胃癌筛查中CEA、糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原72-4(CA72-4)是最常用的生物标志物.然而,在胃癌诊断中CEA、CA19-9 及CA72-4的敏感性只有20.1%~27.6%,而联合检测时也只增加到48.2%[18].Shao等[19]研究发现hsa_circ_0001895的敏感性和特异性分别为67.8%和85.7%,优于常用的胃癌生物标记物.Handong Suna等[20]发现hsa_circ_0000520在组织中的敏感性和特异性分别为53.57%和85.71%,在血浆中的敏感性和特异性分别为82.35%和84.44%.circRNAs在胃癌中的高度失调及其表现出的高度组织特异性,并且特定的环状RNA在转化或在特定的癌症早期阶段具有差异表达,使其成为诊断胃癌的一个理想标志物.

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性.其是人类可遗传的变异中最常见的一种.SNP可以作为预测癌症个体风险的生物标志物.对于SNP是否存在于circRNA上和其是如何参与癌症的,以及circRNA上SNP的临床意义值得研究.

2.2 circRNA可作为评估胃癌预后的指标 现有的抗癌药物不能完全根除癌细胞,大多数类型的癌症经过一段时间会复发.因此,预后评价对预后不良因素的早期干预和癌症患者的预期寿命的延长具有重要意义.近年来,大量的研究表明,circRNA可能对于癌症的预后预测是有用的.例如,circpvt1在胃癌组织中的表达升高,其可以作为胃癌患者总生存期与无病生存期的独立预后指标,进一步的研究显示,circPVT1高表达而PVT1低表达的患者生存期明显高于circPVT1低表达而PVT1高表达的患者,因此circPVT1结合PVT1的表达量是更好的预后指标[17].以往的研究表明,LAST1的缺失与预后不良和复发有关,并且促进胃癌细胞生长和转移[21].Jing等[22]研究发现,miR-424在胃癌组织中表达上调,与LAST1表达呈负相关,而在胃癌组织中的circlarp4通过海绵miR-424和上调LAST1基因抑制细胞增殖和侵袭.circlarp4可以通过miR-424/LATS1/YAP通路的调控抑制胃癌.因此,circlarp4可作为一种肿瘤抑制因子及胃癌患者生存期的独立预后因素.circRNA可作为预测胃癌复发的潜在指标,可以帮助临床医生更好地管理疾病的复发.

3 circRNA潜在的抗癌作用

越来越多的证据显示各种新颖的circRNA和信号通路与癌症的发生或与癌细胞的侵袭之间的关系,其都是公认的产生新药物的治疗靶点.使用基因敲除、反义寡核苷酸和miRNA"海绵"是导致miRNA功能丧失的三种经典方法.基因敲除动物模型的构建是耗时、昂贵和困难的,化学修饰的反义寡核苷酸在短期实验中是有用的,但不能长期地实现对miRNA的抑制.miRNA"海绵"技术可能是一项新技术和基因敲除技术的替代品.因为某些circRNA有特异的miRNA结合位点,其比典型的miRNA抑制剂更有效.随着天然发现的circRNA对miRNA管理,circRNA可能被证明是非常适合携带诱饵型miRNA抑制剂,并认为作为第二代miRNA抑制剂.circRNA"海绵"可能是最好的在细胞内抑制miRNA活性,这些"海绵"可用于靶向癌基因和逆转人类癌细胞的恶性表型.例如,使用T4噬菌体基因TD自我剪接,Liu等[23]构建了一个circRNA"海绵"靶向miR-21、miR-221并用其来治疗恶性黑色素瘤,结果表明,circRNA"海绵"比线性RNA有更强效的抗癌作用.也可通过外源性的引入siRNA去沉默circRNA进而治疗癌症.近年来,无论体内还是体外研究,siRNA沉默circRNA已被有效地应用.circRNA作为microRNA"海绵",重新引入circRNA可以恢复对肿瘤细胞增殖的控制和诱导细胞凋亡.circRNA对蛋白质和miRNA的"海绵"作用和其独特的细胞稳定性能使其成为一个良好的治疗载体.可以通过外源性的导入具有多个致癌蛋白和/或miRNA结合位点的circRNA停止致癌作用[24].

4 挑战与未来展望

在过去几年里关于特定的circRNA与胃癌关系的文章明显增加,然而,circRNA对胃癌发生和进展的确切贡献仍不清楚.在这样的背景下,该领域目前面临的挑战是:(1)揭示具体的circRNA作为促癌或抑癌剂的机制.但这是不容易的,因为circRNA不存在一个共同的机制,其有不同的作用分子模式.(2)目前的方法去检测和鉴定circRNA仍然有限和具有挑战性.(3)此外,为了测试特定的假设,该领域需要开发能够操纵体内circRNA动态的工具.(4)circRNA对胃癌潜在的诊断、治疗和预后的价值需要进一步探索,因为大多数的研究缺乏有形证据和合理配套的临床应用.circRNA作为肿瘤标记物可以作为胃癌的早期筛查,显著增加患者的生存机会.在未来,通过进一步研究circRNA的功能,可以提高对相关的circRNA疾病机制的理解及相关疾病的诊断和预防.circRNA作为一种新型的调节分子已为胃癌的诊断、治疗和预后提供了新的视角.