外泌体：探究结直肠癌发生发展和诊治的新视角

唐卫中

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院广西肿瘤防治研究所

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大最常见的恶性肿瘤，也是导致肿瘤相关死亡的第二大原因，严重威胁人类生命健康。2018年全球CRC新发病例超过180万例，死亡病例约86.2万例［1］，预计到2030年，全球CRC新发病例将达220万例，死亡病例高达110万例［2］。结直肠癌患者发现时多为中晚期，预后差，因此早期诊断和及时治疗对提高CRC患者的生存率和改善其预后尤为关键，研究并寻找高敏感性、高特异性的诊断方法以及更有效的治疗方法具有重要意义。肿瘤微环境与肿瘤的发生发展密切相关，而外泌体作为肿瘤微环境的重要组成部分，近年来成为肿瘤研究领域关注的热点。本文就外泌体在结直肠癌发生发展以及诊断和治疗等方面的研究进行综述。

1 外泌体的生物学特性

1987年，JOHNSTONE等［3］首次在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现一种有膜结构的小囊泡，并将其命名为exosome（外泌体）。外泌体是一种由细胞通过胞吐方式分泌至微环境中的囊泡，直径为40～100 nm，具有磷脂双分子层膜结构。人体中几乎所有类型的细胞在正常生理及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体广泛存在于血浆、唾液、尿液、母乳、羊水、脑脊液等多种体液中［4］。外泌体中富含多种生物活性物质，包括核酸（如 miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA）、蛋白（如融合蛋白、膜转运蛋白、热休克蛋白）、脂质（如胆固醇、磷脂）等，其成分不同取决于源细胞的功能状态［5］。外泌体的释放过程有很多种机制，最主要的是多囊体（MVB）与细胞膜融合。释放的外泌体可通过直接融合过程、受体-配体融合过程或受体介导的内吞作用等方式被受体细胞吸收［6］。大部分进入靶细胞内的外泌体将被溶酶体所降解以供细胞代谢所需，而小部分的外泌体得以释放出内容物，并以此介导细胞间的通讯。外泌体参与细胞间的物质交换，亦是细胞间通讯起关键作用的重要介质，广泛参与了抗原递呈、免疫应答、细胞迁移、细胞分化等机体多种生物学过程［7-9］。随着对外泌体研究的深入，已证实外泌体通过在细胞间传递基因和蛋白等多种重要活性物质而调节肿瘤微环境，在肿瘤发生发展、血管生成和侵袭转移中起重要作用。

2 外泌体在结直肠癌发生发展中的作用

近年来研究表明外泌体在结直肠癌发生发展中扮演重要角色。肿瘤外泌体可以通过在细胞间传递DNA、mRNA、miRNA和癌蛋白等活性物质来改变正常细胞的表型和生物学行为，从而影响肿瘤的发生发展［10］。ZHANG 等［11］采用 EDU 结合试验，检测外泌体源性miR-200b对结直肠癌细胞增殖的影响，以阴性对照外泌体（Exo-NC）处理的HCT-116和SW480细胞系为参照组，结果发现经外泌体源性miR-200b处理的HCT-116和SW480细胞系的增殖能力显著增强，而将HCT-116细胞系中的miR-200b敲除后，该细胞系的增殖能力显著下降，提示外泌体miR-200b具有调控结直肠癌细胞生长的潜在能力。细胞所处的宿主缺氧是CRC重要的微环境特点，在缺氧条件下，由CRC细胞分泌的外泌体Wnt4尤其丰富，而Wnt4激活的β-catenin信号是内皮细胞增殖和迁移的重要信号通路。研究表明缺氧的CRC细胞源性外泌体通过在内皮细胞中传递Wnt4 mRNA来激活β-catenin信号，增强内皮细胞的增殖和迁移能力，从而促进肿瘤生长和血管生成［12］。PENG等［13］研究发现来自CRC小鼠细胞系CT26的外泌体显著促进肿瘤生长，降低动物存活率。肿瘤相关的巨噬细胞表现出M2表型，能够与肿瘤微环境的细胞因子和趋化因子相互作用。该研究还发现CRC外泌体能够将巨噬细胞从M1型转化为M2型，从而促进肿瘤的生长。肿瘤来源外泌体因含有多种免疫抑制分子而在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。CHEN等［14］发现结直肠癌外泌体蛋白SERPINA1、SERPINF2和MMP9表达上调与肿瘤生长的免疫逃逸有关。肿瘤转移包括多个步骤，首先肿瘤细胞通过上皮细胞间充质细胞转化（EMT）脱落，经物理转运转移到远端器官。然后，肿瘤来源的外泌体作为肿瘤微环境的关键组成部分，使肿瘤细胞逃脱免疫监视，安排转移点以便脱离的癌细胞植入［15］。LAN等［9］研究发现M2型巨噬细胞源性外泌体中的miR-21-5p和miR-155-5p表达水平显著升高。miR-21-5p和miR-155-5p通过M2型巨噬细胞源性外泌体转移到结直肠癌细胞中，与BRG1编码序列结合并下调BRG1的表达，而BRG1在结直肠癌中表达下调被认为是促进结直肠癌转移的关键因素，表明M2型巨噬细胞通过外泌体靶向下调BRG1的表达，诱导结直肠癌细胞迁移和侵袭。WANG等［16］研究发现，来自高度肝转移潜能的结直肠癌细胞系（HT-29）的外泌体可以显著增加低度肝转移潜能结直肠癌细胞系（Caco-2）转移瘤的负荷。该研究还发现采用HT-29来源外泌体处理的小鼠CXCR4表达水平相对较高，表明外泌体可能通过招募表达CXCR4的间质细胞，形成一个有利于肿瘤转移的微环境，从而促进结直肠癌转移。另外，体外研究发现使用HT-29源性外泌体处理后，Caco-2细胞的迁移能力显著增强，进一步表明外泌体在调节结直肠癌源性肝转移中发挥作用。GAO等［17］通过细胞迁移和侵袭实验检测外泌体lncRNA 91H对CRC细胞和正常人肠上皮细胞（FHC）的影响。结果发现，CRC细胞经肿瘤外泌体lncRNA 91H处理后迁移能力和侵袭性均明显增强。这些结果均提示外泌体lncRNA 91H可能与CRC细胞增殖、迁移和侵袭密切相关。ZENG等［18］研究发现miR-25-3p可以通过外泌体将CRC细胞转移到内皮细胞。外泌体miR-25-3p通过靶向KLF2和KLF4调控内皮细胞中VEGFR2、ZO-1、闭合蛋白和闭合蛋白5的表达，从而促进血管通透性和血管新生。因此，外泌体介导的miRNA、lncRNA等核酸分子和蛋白质等活性物质的交换，对结直肠癌发生演进过程中细胞的生长、增殖、迁移、侵袭、转移以及免疫应答等发挥着至关重要的作用。

3 外泌体在结直肠癌中的临床应用

3.1 外泌体作为结直肠癌诊断和预后标志物

CRC患者的预后与疾病分期有关，CRC早期患者5年生存率可达90%，而晚期患者5年生存率不到10%。由于目前缺乏有效的早期诊断方法，大多数CRC患者确诊时已为中晚期，预后效果欠佳。因此，寻找CRC高敏感性和高特异性的早期诊断、疗效预测和预后评估生物标志物对早期发现、早期诊断和治疗CRC，提高CRC患者生存率具有重要意义。外泌体携带大量的蛋白质和核酸，尤其是miRNA、lncRNA等RNA分子含量丰富，因此目前越来越多的研究关注外泌体作为CRC分子标志物的应用价值。ZHANG等［19］研究发现，在CRC血浆外泌体中miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-18a-5p、miR-18b-5p 表达显著升高，提示这些miRNA可作为CRC潜在的非侵入性诊断标志物。此外，有研究［20］发现，校正年龄、性别、血管浸润肿瘤分级、TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）和转移情况等因素后，发现血清外泌体miR-548c-5p水平的降低与CRC总体生存时间缩短独立相关（HR=3.40，95%CI：1.02～11.27）。该研究结果提示外泌体miR-548c-5p不仅可用于CRC鉴别诊断，在预后评估中也有一定的临床价值。HU等［21］研究将CRC患者6个血清外泌体lncRNA（LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602）表达水平与健康对照组比较，结果发现CRC患者的这6个血清外泌体lncRNA表达水平明显升高，有望作为CRC早期诊断生物标志物。SUN等［22］发现外泌体CPNE3水平在CRC患者尤其是TNM晚期或远处转移患者中显著升高，联合检测外泌体CPNE3和CEA诊断CRC，敏感度、特异度分别为81.2%、84.8%，明显优于单独检测外泌体CPNE3（敏感度、特异度分别为67.4%、84.4%）或者CEA（敏感度、特异度分别为54.3%、93.7%）。此外，外泌体CPNE3表达水平较低的CRC患者的无病生存期（HR=2.9，95%CI：1.3～6.4）和总生存期（HR=3.4，95%CI：1.2～9.9）显著长于外泌体 CPNE3 表达水平较高的CRC患者。该研究结果提示CRC外泌体CPNE3可用于CRC早期诊断和预后评估。3.2 外泌体与结直肠癌化疗耐药性

化疗是结直肠癌目前重要的治疗手段之一，然而长期使用化疗药物导致耐药是结直肠癌化疗疗效降低甚至化疗失败的主要原因。研究［23］表明，外泌体在肿瘤微环境中可通过促进药物外排、传递耐药分子等方式来增强肿瘤细胞对药物的耐受作用。REN等［24］研究发现，与正常成纤维细胞衍生外泌体处理相比，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）衍生外泌体处理显著增强了CRC细胞肿瘤干细胞的成球能力，降低了奥沙利铂诱导的细胞凋亡。当使用外泌体抑制剂GW4869对CAFs外泌体分泌进行阻断时，细胞凋亡明显增加，表明CAFs可能通过分泌外泌体增强结直肠癌干细胞特性耐药性。另外，研究还发现在CAFs衍生外泌体中lncRNA H19富集，且CAFs可通过外泌体将lncRNA H19转移到CRC细胞，同时肿瘤组织中lncRNA H19的表达水平经CAFs来源的外泌体处理后显著增加，上述结果提示CAFs来源的外泌体向CRC细胞转移lncRNA H19从而促进结直肠癌干细胞特性和奥沙利铂耐受。该研究对CRC发生机制及化疗药物耐受过程进行了阐述，为CRC的临床治疗提供了新的思路和靶标。HU等［25］研究发现成纤维细胞外泌体中的主要重编程调控因子是Wnts，外泌体Wnts可增加分化CRC细胞的Wnt信号通路活性和耐药性，而抑制Wnt的释放可减弱这种效应。该研究结果表明，成纤维细胞外泌体Wnts可诱导肿瘤细胞去分化进而促进CRC的化疗耐药，提示干扰外泌体Wnt信号可能有助于提高化疗敏感性。YANG等［26］研究结果显示，来自西妥昔单抗耐药细胞的外泌体UCA1的表达显著增加，并将西妥昔单抗耐药性传递给受体敏感细胞。该研究表明UCA1可能在西妥昔单抗耐药中发挥作用，外泌体UCA1在CRC细胞中传送西妥昔单抗耐药，导致受体细胞中产生更大的西妥昔单抗耐药性，提示外泌体UCA1对预测CRC患者西妥昔单抗耐药性具有潜在的临床意义。研究外泌体对结直肠癌化疗耐药性的影响将有助于进一步阐明结直肠癌耐药的分子机制，也为克服或逆转结直肠癌耐药提供新思路，例如通过抑制外泌体释放、改变外泌体成分等方式逆转结直肠癌耐药性［27］。

4 总结和展望

自1965年Gold证实糖蛋白抗原在检测人类结肠癌中的作用以来，许多结直肠癌相关的血清肿瘤生物标志物被广泛研究。外泌体的发现和研究为CRC的精准诊断和治疗开辟了新的领域和方向。相较传统液体活检所检测的细胞游离核酸和循环肿瘤细胞，外泌体在体液中浓度较高，易于富集，所包含的母细胞信息能长期稳定存在并保持一定的生物学活性，而且外泌体所含的RNA、蛋白质等可反映疾病进展、治疗反应及转归，因此外泌体在临床诊疗中具有很好的应用前景。然而目前针对外泌体的研究仍存在一些不足，如从体液中分离提取外泌体的技术和方法仍有待改进。在准确寻找外泌体靶基因，了解外泌体作用机制、目标蛋白、信号通路等方面也仍存在巨大的挑战。随着蛋白质组学、高通量测序、转录组学及生物信息学分析等技术的快速发展，人们对外泌体在结直肠癌发生发展过程中的机制及其临床应用价值研究将不断深入，为结直肠癌早期诊断与治疗、疗效预测与预后判断等方面开辟新的视角。