cfDNA在非小细胞肺癌中的研究进展*

曹轲，陈正庭 综述，常莉，李文辉 审校

650118昆明，昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院 放射治疗中心(曹轲、陈正庭、常莉、李文辉)，云南省肺癌研究重点实验室(曹轲、陈正庭)

细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)于1948年被首次报道[1]，是血液中双链DNA的组成部分之一，并可从血浆中分离出来[2]。肺癌作为最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率居癌症之首，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌分型的85%。研究表明，与健康对照组或良性疾病组相比，NSCLC患者血浆中的cfDNA水平较高[3]，且cfDNA高水平患者具有更短的无进展生存期(progress free survival，PFS)和总生存期(overall survival，OS)[4]。所以，分析患者血浆中cfDNA或许对NSCLC患者的早期临床诊断、基因突变检测以及预后的预测、耐药性监测等方面有着重要价值，并有望成为重要的液体生物标志物和指导NSCLC精准治疗模式中的新方法。为此，本文就cfDNA在非小细胞肺癌研究中的最新进展情况作一综述。

1 cfDNA

目前认为，cfDNA通过细胞凋亡或坏死释放到血液中，通常是长度为150～200个碱基对的双链片段[1]。研究发现，在健康人血浆中，正常细胞cfDNA浓度约为30μg/L，而肿瘤患者则为180μg/L，且血浆中cfDNA分子会被迅速清除，其半衰期为30分钟至2小时[5]。早在1977年，Leon等[6]就发现癌症患者cfDNA总体水平高于未患癌人群，而在癌症患者中，从肿瘤细胞释放的cfDNA通常被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，但其仅构成整个cfDNA的一部分，且癌症患者整个cfDNA中ctDNA所占比例差异巨大，根据肿瘤大小、定位和血管分布，从少于 0.1%至多于90%之间变化[7-8]。虽然个体患者的ctDNA所占比例往往与肿瘤负荷平行，但在患相同类型癌症的不同患者之间，已观察到显著的变异，这可能反映了个体肿瘤的生物学差异或细胞死亡率差异。此外，不同类型癌症的患者在可检出的ctDNA频率方面也有显著变异。故如何在正常种系cfDNA背景中检测和分析ctDNA仍是一大难题。

2 cfDNA的检测和分析

由于来自肿瘤的cfDNA含量低、半衰期短，且不同癌症患者之间个体差异大，故需要超灵敏的方法来检测血浆cfDNA中以极低频率存在的变异体-等位基因突变、拷贝数变化以及其他改变。如今已有多种方法可以检测血浆cfDNA中的基因突变情况，包括测序法、荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)、突变富集PCR、变性高效液相色谱法以及数字PCR。近年来，在数字PCR基础之上又衍生出如微滴数字PCR技术(droplet digital PCR, ddPCR)和微乳滴磁珠PCR以及微数字PCR[9]，ddPCR技术甚至可以识别和定量cfDNA中以≤0.001%的等位基因频率存在的变化[10]。然而，这些方法的灵敏度和特异度受到DNA聚合酶错误率和测序反应的限制。新一代测序(next-generation sequencing，NGS)方法针对cfDNA进行了定制，多项研究表明，NGS结合了深度测序覆盖、分子条形码方法和错误抑制算法的改良方法改进了检测限，其范围包括从全基因组或全外显子组测序到有限基因组的靶向测序，大大提高了检测的准确性和敏感性[11-15]。

3 cfDNA在NSCLC中的应用

肿瘤组织的病理诊断及相关分子检测一直是临床医师诊断和治疗的金标准。在未接受活检的NSCLC患者中，涉及血浆cfDNA的液体活检技术是分析临床相关遗传改变的重要材料来源之一。虽然诸如循环肿瘤细胞、外泌体以及RNA亦可作为液体活检的检测对象，但对于携带基因突变的许多NSCLC患者而言，血浆cfDNA的液体活检技术才是最合适的选择，甚至优于标准肿瘤标志物，例如CEA和CA12-5、CA15-3、CA19-9[13,16-18]。因此，笔者将从以下几个方面对cfDNA在NSCLC中的应用进行相关阐述。

3.1 cfDNA用于NSCLC患者早期临床诊断

早期发现和早期治疗是提高癌症患者生存率的关键，与晚期癌症患者相比，没有影像学转移性病变的患者预后更佳。Szpechcinski等[19]利用PCR方法检测NSCLC患者(I期44%，II期40%，IIIA期16%)、慢性呼吸系统疾病患者以及健康志愿者，发现NSCLC患者的血浆cfDNA浓度水平显著高于慢性呼吸系统疾病患者和健康个体，同时在区分NSCLC患者与健康个体时，其灵敏度和特异度分别为90%和80.5%。Newman等[12]利用一种超灵敏的量化ctDNA方法(CAPP-Seq)检测发现，即使当cfDNA含量达到0.02%的检测限时，仍然在100%的II～IV期NSCLC患者和50%的I期患者中检测到cfDNA，且突变基因部分的特异性为96%。国内的一项研究结论也得出血浆cfDNA可作为NSCLC早期诊断和临床分期的有效工具[20]。虽然目前已有多项研究表明血浆cfDNA在NSCLC患者早期临床诊断中的作用，但大部分为小样本研究，仍缺乏关于早期NSCLC患者血浆cfDNA检测的大规模研究，这可能与确诊的早期NSCLC患者较少从而收集相关数据困难有关。同时有研究也提出了质疑，例如一项前瞻性研究显示血浆cfDNA对早期NSCLC患者检测的特异性高但敏感性低，该研究招募了288名NSCLC患者，并使用NGS作为I～IV期NSCLC患者ctDNA中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变的检测方法，结果显示外显子19缺失的诊断敏感性和特异性分别为50.9%和98%，并且对于L858R突变为51.9%和94.1%，所有病例的整体敏感度为54.4%，IIIB～IV期为72.7%，但IA～IIIA期为22.2%[21]。以上研究显示出血浆cfDNA在NSCLC早期临床诊断领域仍存在一定争议，需要进一步的研究来确立其效用，但不可否认的是血浆cfDNA检测为早期肿瘤的微创检测提供了广泛适用的方法，并为NSCLC患者的早期筛查和临床诊断提供了一定的依据。

3.2 cfDNA用于NSCLC基因检测及预后预测

3.2.1 EGFR EGFR是一种属于酪氨酸激酶ErbB家族的跨膜蛋白受体，编码基因位于第7号染色体短臂，由酪氨酸激酶结构域的突变导致信号转导途径的激活，从而引发细胞增殖和抗凋亡[22-23]。在NSCLC中最主要的驱动基因就是EGFR，既往数据表明，EGFR基因突变率在白种人患者中约10%～15%，而在亚洲人患者中却高达40%[24]，其主要发生在18号-21号外显子内，最常见的是19号外显子缺失和21号外显子L858R碱基替换[25]。以上这些外显子的突变赋予酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKIs)的敏感性，并显示出其与药物高反应率(>70%)和PFS相关[26-28]。一项研究报道了血浆cfDNA中EGFR基因突变的存在与EGFR-TKIs的反应之间有显著相关性，并且在血浆和肿瘤组织同时发现L858R突变的患者与仅在组织中发现L858R突变的患者相比，前者的OS较短[29]。

迄今为止，已经开发出了三代EGFR-TKIs，虽然其显示出较好的早期临床获益，然而患者由于耐药性的产生导致最终复发。国内最近的一项研究利用ARMS法检测血液cfDNA中EGFR基因突变并监测耐药基因T790M的变化，同时评估TKI在靶向治疗患者中的预后价值，其结果显示血液cfDNA和肿瘤组织样本活检在EGFR突变检测上的总体一致率为68.2%，结论提示应用ARMS法检测血液cfDNA的EGFR基因突变是一种特异性高、敏感好的检测方法，适用于晚期NSCLC患者治疗前的EGFR基因突变状态检测，同时适用于监测靶向治疗后T790M耐药突变状态和预测患者预后[30]。由此可见，血浆cfDNA检测与组织活检在确定EGFR基因突变方面存在具有高度一致性，虽然肿瘤组织的活检传统上对于组织学鉴别原发性和转移性肺肿瘤，以及确定相关EGFR基因突变的存在是必不可少的，且肿瘤组织中的基因检测仍是这些应用的金标准。然而，约25%的NSCLC患者为晚期疾病，由于取材困难等问题，肿瘤活检不足以实现全面的基因检测，为了能使EGFR-TKIs更好地应用于EGFR基因突变的NSCLC患者，血浆cfDNA液体活检技术的发展已经能够在血浆中进行检测，这样对于晚期NSCLC患者来说，其可作为组织活检的替代检测方式。

一些研究利用血浆cfDNA评估了EGFR基因突变的NSCLC患者接受EGFR-TKIs治疗后的临床效用，发现血浆cfDNA中的突变状态与PFS或OS之间存在显著相关性，其结果都显示出NSCLC患者在接受靶向治疗后OS或PFS呈上升趋势[31-33]。这些研究都提示血浆中cfDNA浓度水平在评估NSCLC患者在接受靶向治疗后的预后上具有极大价值，并能够反映NSCLC患者潜在的肿瘤负荷情况，因为肿瘤负荷较高的NSCLC患者可能有更密集的cfDNA释放到血液中，所以其浓度水平可以通过治疗引起的肿瘤细胞死亡来调节，在NSCLC患者接受靶向治疗后出现短暂性上升，而随着肿瘤的退缩迅速下降。因此，cfDNA可以作为监测肿瘤负荷的替代指标，并使其成为评估NSCLC患者的宝贵预后因素。

3.2.2 Kristen鼠肉瘤病毒原癌基因同源体(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS) KRAS基因是RAS家族的一个原癌基因。在NSCLC的不同组织病理学类型中，尤其是肺腺癌中，KRAS基因突变率在东西方人种中差异较大;该基因突变是西方人种最常见的突变基因，突变率接近30%，但在亚洲人群中突变率仅为5%[34]。研究发现，KRAS基因编码的蛋白主要位于EGFR信号途径的下游，该突变可导致MAPK信号通路持续激活, 从而加速肿瘤细胞的增殖。KRAS基因突变最常发生在2号外显子的第12位和第13位密码子[35]。迄今为止, 针对KRAS突变的靶向药物研发工作仍在艰难进行中，尚无临床广泛应用的靶向药物。尽管有研究报道针对TP53和KRAS突变的免疫疗法已显示出一定的前景[36]，但目前对于携带KRAS基因突变的NSCLC患者，化疗才是一线选择。

传统上，在NSCLC患者的活组织检查中检测到KRAS基因突变与预后不良有关。然而，血浆cfDNA作为预后标志物在评估KRAS基因突变的NSCLC患者的价值仍值得进一步探讨。Nygaard等[37]利用血浆cfDNA对可接受化疗的246例晚期NSCLC患者进行至少1个周期(最多6个周期)的最小剂量化疗后评价预后，发现17.5%血浆KRAS基因突变患者(治疗前检测)，其OS和PFS较野生型KRAS基因突变的患者明显缩短，化疗对于血浆KRAS基因突变组的有效率也明显低于野生型KRAS基因突变组；并且，同一研究组的另一项前瞻性研究纳入了69例晚期NSCLC患者，并分析这些患者在治疗期间血浆cfDNA与KRAS基因突变的动态变化，发现当患者血浆cfDNA浓度高于基线水平时提示预后不良，同时在治疗过程中若血浆cfDNA水平发生变化，疾病进展显著增加[38]。这些研究都表明血浆cfDNA中检测到KRAS基因突变的存在可能是预后不良的标志。可另一项Meta分析结果却提示血浆cfDNA中检测到KRAS基因突变可能不是NSCLC患者生存的预后因素[39]。一种原因可能是，在发生KRAS基因突变的NSCLC患者中，血浆cfDNA作为预后和预测生物标志物的真正价值被高估了，另一个原因可能是利用血浆cfDNA检测KRAS基因突变用于预测NSCLC患者预后的研究较少。虽然作为生物标志物的cfDNA在血浆中检测到KRAS基因突变的预后和预测价值仍存在争议，但其体现的作用却不可忽视，所以仍需要样本数更多的前瞻性研究得出明确的结论。

3.2.3 间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK) ALK是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在正常情况下，ALK受体可与配体结合引起ALK二聚化和下游激酶信号转导，影响下游信号通路，包括RAS/MEK/ERK通路和PI3K/Akt/mTOR通路，从而促进细胞生长和增殖[40-41]。据统计，大约3%～5%NSCLC中会出现ALK基因重排[42]。Soda等[43]于2007年通过蛋白组学技术在肺腺癌肿瘤组织中首次发现ALK融合基因，即ALK与棘皮动物微管蛋白4(echinoderm microtubule-associated protein like 4, EML4) 形成EML4-ALK融合基因，其产生的融合蛋白可引起ALK的胞内激酶结构域发生二聚化，激活经典的ALK下游信号通路导致细胞增殖与凋亡失控。

虽然传统的化疗方案对ALK阳性 NSCLC患者疗效并不理想，但针对ALK阳性的靶向药物间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂(ALK-tyrosine kinase inhibitor,ALK-TKIs)不仅提升了临床疗效，同时极大程度修改了对于ALK阳性NSCLC患者的临床用药指南，成为世界范围内公认的一线治疗手段。在当前的临床实践中，有4种不同方法来检测ALK融合基因的表达，分别是荧光原位杂交、免疫组织化学、逆转录聚合酶链式反应以及NGS。虽然肿瘤组织仍然是首选材料，但有部分研究也证明血浆cfDNA NGS检测提供了一种非侵入性的方法来检测ALK基因重排和ALK融合基因，同时其具有良好的灵敏度和优异的特异性，不仅可以检测新诊断的ALK阳性 NSCLC患者的靶向改变，对于已远处转移的NSCLC患者也具有意义[44-46]。如上所述，多项研究都表明血浆cfDNA可作为检测ALK基因重排以及ALK融合基因的实用性方法，为获取肿瘤组织困难的患者提供可靠和连续的检测方式，这也间接地说明了当NSCLC患者检测出ALK基因重排或ALK融合基因时，能够尽早选择并使用ALK-TKIs来延缓疾病的进展，而当ALK阳性的NSCLC患者出现ALK耐药突变体时，cfDNA也具备及时检测出新发耐药机制的能力，特别是对于疾病进展迅速或出现ALK耐药突变体的NSCLC患者，每一代ALK-TKIs针对的耐药突变体不同，选择合适及正确的ALK-TKIs不仅可以减轻患者的经济负担，还可以精确有效治疗这类患者。

ALK阳性的NSCLC患者在接受ALK-TKIs治疗后，不仅疗效显著，并且患者预后和生存率也得到大幅度改善[47]。国内最近的一项回顾性分析纳入了174例克唑替尼治疗的携带ALK基因重排并已有脑转移的NSCLC患者，结果显示即使这类患者也可以从克唑替尼中获得生存方面的益处[48]。如前所述，血浆cfDNA新一代测序(next-generation sequencing，NGS)检测存在远处转移的NSCLC患者，并且具有高敏感性和高特异性的特点，这也提示血浆cfDNA在检测远处转移伴ALK基因重排或ALK融合基因的NSCLC患者方面具有独特的作用，因为脑转移或肝转移的NSCLC患者预后较差且远期生存率较低，所以尽早发现远处转移的NSCLC患者是否存在ALK基因重排或ALK融合基因，并及时选择正确的ALK-TKIs具有十分重要的意义。虽然关于血浆cfDNA检测在评估EGFR或KRAS基因突变的NSCLC患者预后的研究很多，可目前对于ALK基因重排或ALK融合基因的NSCLC患者，利用血浆cfDNA评估其接受ALK-TKIs治疗后临床效用的研究却十分缺乏。这也提示，对于ALK阳性的NSCLC患者，虽然血浆cfDNA在评估其预后方面具有一定的前景，但仍需要大量研究来证明其效用才可以得出明确的结论。

3.3 cfDNA用于NSCLC中耐药性监测

3.3.1 EGFR-TKIs获得性耐药监测 如前所述，EGFR-TKIs对于EGFR基因突变的NSCLC患者来说占据重要地位。与单纯接受化疗或放化疗联合的患者相比，放化疗联合标准一线EGFR-TKIs(如吉非替尼，厄洛替尼或阿法替尼)治疗的EGFR基因突变患者客观缓解率(objective response rate，ORR)、PFS和生活质量均明显更好[27,49-51]。然而不幸的是，大多数患者都存在不可避免的获得性耐药，而T790M次级突变是最常见的耐药机制，占近60%的病例[52-53]。在这种情况下，相比于手术活检，使用血浆cfDNA的液体活检优势在于可以进行频繁采样，当使用EGFR-TKIs治疗EGFR基因突变的NSCLC患者时，cfDNA在血浆中减少甚至消失，且这种情况与T790M次级突变一起再次出现。因此，对于发生T790M次级突变的NSCLC患者来说，组织活检往往可行性差，而血浆cfDNA的液体活检技术在EGFR-TKIs的治疗背景下显得十分重要，目前正用作手术活检的替代方法，一些研究也已经证明，血浆cfDNA中检测到T790M次级突变的NSCLC患者，可选择第三代EGFR-TKIs进行治疗[54-56]。

第三代EGFR-TKIs(奥希替尼)可以与T790M受体结合，目前已被批准用于治疗进展为EGFR-TKIs耐药并携带T790M次级突变的NSCLC患者[57]，是针对T790M次级突变的高选择性且不可逆性的药物。临床研究结果显示，该药对发生T790M次级突变的NSCLC患者疗效显著，反应率为55%，PFS中位数为9.6～13.1个月[58-59]。但使用第三代EGFR-TKIs仍然导致了新的抵抗机制，Thress等[60]研究报道，EGFR基因突变的NSCLC患者通过C797S突变的机制从而发生了奥西替尼抗性，其对来自7名发生奥西替尼抗性的NSCLC患者，利用ctDNA进行NGS检测，其中一例患者表现出C797S突变，而连续收集的15例携带T790M次级突变并接受AZD9291处理的NSCLC患者，利用ctDNA进行ddPCR检测，发现奥西替尼抗性的3种分子亚型，其中6例携带C797S突变，5例有T790M次级突变而没有C797S突变，4例仅发现EGFR基因突变。c-MET扩增或过表达是另一种可导致EGFR-TKIs治疗失败的获得性耐药机制，约占病例的5%～20%，其可以激化下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、生长、迁移和血管生成[61]。目前关于抗MET单克隆抗体和MET-TKIs的疗效正在非T790M患者的临床试验中进行[62]。其他耐药机制还包括ERBB2扩增(12%～13%的病例)，PIK3CA突变(约5%)，BRAF突变(1%)和组织学转化[63]。因此，对于发生获得性耐药性机制的NSCLC患者，血浆cfDNA的液体活体技术可以利用频繁取样的优势使其成为个体化医疗中最重要的应用，并能让临床医生采用更有效的替代治疗策略。

3.3.2 ALK-TKIs获得性耐药监测

虽然ALK-TKIs的疗效取得了瞩目进展，ALK阳性患者最初对ALK-TKIs反应良好，但获得性耐药依旧不可避免，绝大多数患者会在几年内出现继发性耐药，而其耐药机制主要包括：1)ALK继发性耐药突变(激酶域的点突变和ALK融合基因拷贝数目的扩增)；2)旁路信号通路活化；3)继发性自噬；4)上皮间质转化。在ALK-TKIs获得性耐药中最常见的为L1196M，其次为G1269A、C1156Y、G1202R、I1171T、S1206Y、E1210K等[64]。第一代ALK-TKIs克唑替尼对于ALK阳性的晚期NSCLC亚裔患者，在PFS和客观缓解率ORR方面都具有显著疗效[65]。第二代ALK-TKIs(色瑞替尼和阿雷替尼)虽然对克唑替尼耐药性敏感，但耐药谱却各不相同，例如色瑞替尼对存在L1196M、G1269A、I1171T和S1206Y耐药突变的细胞有明显抑制作用，但对G1202R和F1174C耐药性突变无效，而阿雷替尼能够克服L1196M、C1156Y和F1174L等耐药相关的突变从而产生疗效[66]。第三代ALK-TKIs劳拉替尼则克服了目前已知的多种ALK耐药突变体，是唯一强效抑制包括G1202R在内的所有ALK二次突变ALK-TKIs，对于使用过多线ALK-TKIs治疗后仍复发的患者而言，其对复合型突变也有效，且具有较好的PFS和ORR[67-68]。但目前也有研究表明在接受劳拉替尼治疗后复发的患者中检测到了L1198F突变[69]。如上所述，尽管获得了最初的临床益处，但大部分患者最终仍因不同的耐药机制而复发。Bordi等[70]分析了20例ALK阳性的晚期NSCLC患者，在4/20(25%)患者的血浆cfDNA中检测到ALK耐药性突变，在1例中观察到伴随的L1196M和G1269A，表明获得性抗性机制的异质性；此外，在10/20(50%)病例中检测到KRAS突变，其中3例中出现了ALK基因突变。由此可表明，血浆cfDNA在检测ALK基因突变的新发耐药机制以及可能的旁路途径方面有着高灵敏度和高特异性的特点，其对ALK阳性NSCLC患者具有重要指导意义。

在NSCLC的众多治疗手段中，特别对于发生基因突变的NSCLC患者，靶向治疗起着十分重要的作用，而血浆cfDNA的液体活检技术不仅可以检测NSCLC患者的基因突变，同时还能识别获得性耐药的新发遗传改变，进而采用适合的TKI进行治疗，更好地指导临床用药，这极大程度上提高了临床治疗效率，并且其在患者的早期诊断、预测患者预后方面也展现出极高的价值，为NSCLC靶向治疗计划提供了新的依据和参考。

4 总结与展望

在NSCLC的发展过程中，特别是晚期NSCLC，相比于组织活检或标准肿瘤标志物，血浆cfDNA的液体活检技术能够便捷并有效地监测患者的疾病进展情况，从而选择更有针对性的治疗方案。尽早确定NSCLC患者的分子分型是选择并接受靶向制剂的必要条件，然而目前的基因突变分析往往基于肿瘤组织，并有许多局限性，因为大多数NSCLC患者确诊时已为晚期，由于取材等问题，不适合通过侵入性手术或活检提供组织，而血浆cfDNA的液体活检技术由于其微创性的性质，是十分有前途的来源并作为基因突变分析的检测工具。同时，随着免疫治疗在NSCLC中发挥作用的研究被证实，多项研究也显示出血浆cfDNA监测可作为免疫治疗反应的早期指标，并可用于监测癌症患者对免疫疗法的反应[71-72]，最新的一项研究利用血浆cfDNA实时监测晚期NSCLC患者服用纳武单抗有效性，其结果表明血浆cfDNA在免疫治疗抗性的实时监测中可能具有潜在作用[73]。综上所述，血浆cfDNA的液体活检技术在NSCLC的早期临床诊断、基因突变检测以及预后的预测、耐药性监测等方面均有着重要的应用价值，且在免疫治疗中的早期反应监测以及药物抗性监测等方面也逐渐发挥出相应作用，有望成为指导非小细胞肺癌精准治疗模式中的新方法。

作者声明：本文全部作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；并承诺论文中涉及的原始图片、数据资料等已按照有关规定保存，可接受核查。

学术不端：本文在初审、返修及出版前均通过中国知网(CNKI)科技期刊学术不端文献检测系统的学术不端检测。

同行评议：经同行专家双盲外审，达到刊发要求。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

文章版权：本文出版前已与全体作者签署了论文授权书等协议。