测定鲜活水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量前处理条件的优化

◎ 朱飞如，冯俊富

（北海市食品药品检验所，广西 北海 536000）

孔雀石绿（Malachite green，MG）是人工合成的有机化合物，在鱼体内可代谢为隐色孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）。MG是有毒的三苯甲烷类化合物，既是染料也是药物，长期超量使用有潜在致畸、致癌和致突变等副作用。若在生物体内长期蓄积,食用者身体健康将会受到危害[1]。

目前，文献报道的MG、LMG相关的检测主要方法有液相色谱法、液相色谱串联质谱方法，国内检测此类药物的标准有GB/T 19857-2005、SN/T 1479-2004、SC/T 3021-2003。目前检测的方法虽多，但前处理过程中试剂消耗大，步骤麻烦，成本较高。近年不断发展起来比较成熟的一种高效的检测技术是高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），可以同时发挥液相色谱的分析速度快、分离度高与串联质谱的高灵敏度、高选择性的极大优势，并且是采用多反应检测扫描方式，较好的对目标化合物进行定量和定性分析。本实验在借鉴标准、文献的基础上，旨在建立测定的简便方法。同时按照GB/T 19857-2005方法处理样品，与之做相应比较。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 6460液质联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；3-18KS高速台式冷冻离心机（SIGMA实验室离心机有限公司）；N-EVAP112氮吹仪（美国organomation公司）；CPX5800H-C超声波清洗机（美国必能信超声（上海）有限公司）；QL-901涡旋混合器；GM200刀式研磨仪（法国莱驰）。

1.2 试剂

标准溶液：孔雀石绿草酸盐溶液（A Chemtek，101.5 μg·mL-1）；隐色孔雀石绿溶液标准样品（农业部环境保护科研监测所，100 μg·mL-1）；孔雀石绿-D5苦味酸盐溶液（A Chemtek，99.0 μg·mL-1）；隐色孔雀石绿 -D6溶液（A Chemtek，107.2 μg·mL-1）。

乙腈、甲酸均为色谱纯，其他试剂为分析纯；水为超纯水；中性氧化铝（100～200目）。

2 方法

2.1 色谱及质谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18RRHD色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈∶5 mmol/L乙酸铵（75∶25），使用冰乙酸调节pH至4.5；流速为0.2 mL·min-1；柱温 35 ℃；进样量 10 μL。

电喷雾离子源（正离子模式）；多反应监测模式；电喷雾电压4 000 V；离子源流速8 L·min-1；雾化气压力206.85 kPa；离子源温度300 ℃，其他参数见表1。

表1 2种待测物质和2种内标的质谱条件表

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标储备液的制备

精密量取D5-MG和D6-LMG标准溶液各1 mL，置于25 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标储备液。

2.2.2 内标工作溶液的制备

精密取内标储备液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为内标工作溶液。

2.2.3 标准储备液的制备

精密量取MG和LMG标准溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。

2.2.4 标准工作液的制备

精密量标准储备液0.1 mL，置20 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为标准工作液。

2.2.5 5 mmol·L-1乙酸铵溶液

准确称取0.385 g乙酸铵，用超纯水溶解并定容至1 L，用冰乙酸调节pH至4.5。复溶溶液：5 mmol·L-1乙酸铵溶液和乙腈按照1∶1(V∶V)混合4 ℃冷藏备用。

2.2.6 供试品的制备

称取已匀浆的样品2 g（精确到0.01 g），置于50 mL具塞离心管中，加入50 μL内标溶液，加入5 mL乙腈，涡旋2 min，超声波振荡提取10 min后，以10 000 r·min-1离心3 min，将上清液转移至15 mL离心管中；向残渣加入4 mL乙腈重复提取1次，用玻棒捣碎离心管的残渣，旋涡混合器上振荡30 s，超声波振荡提取5 min，以10 000 r·min-1离心5 min，上清液合并至15 mL离心管中，用乙腈定容至10 mL，摇匀，加入2 g中性氧化铝，涡旋2 min，以10 000 r·min-1离心2 min，精密取上清液5 mL置于10 mL量瓶中，加5 mmol·L-1乙酸铵（pH=4.5）定容到刻度，摇匀，过0.22 μm有机滤膜，作为供试品溶液。

2.2.7 空白溶液的制备

除不加样品外，其他与2.2.6步骤一致。

2.3 线性关系考察

精密取标准工作液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL和2.5 mL分别置于10 mL量瓶中，分别精密加入内标工作溶液25 μL，加复溶溶液稀释至刻度，混匀，得到质量浓度d1至d7依次为0.5、1、2、5、10、20、50 μg·kg-1的标准系列浓度。按2.1项下的条件进行测定，记录色谱图。以标准液的质量线性浓度（μg/kg）作为横坐标（X），以MG和LMG的标准峰面积与内标D5-MG和D6-LMG的峰面积比值为纵坐标（Y）。MG的线性回归方程为Y=0.068 393X+0.007 885，相关系数为0.999 96；LMG的线性回归方程为Y=0.203 102X-0.004 221，相关系数为0.999 97。结果表明，MG和LMG的标准峰面积与内标D5-MG和D6-LMG的峰面积比值与检测浓度呈良好的线性关系。

2.4 最低检出限

称取已匀浆的阴性样品1份，置于50 mL具塞离心管中，加入标准工作液0.05 mL，按照“步骤2.2.6”同步操作，以基线噪音的3倍计算，得到MG和LMG的最低检出浓度分别为 0.16 μg·kg-1和 0.10 μg·kg-1。

2.5 重复性实验

精密取标准工作液0.25 mL，置于10 mL量瓶中，加入内标工作溶液25 μL，加复溶溶液稀释至刻度，混匀，按本方法条件进样6次，记录色谱图，其中MG的RSD为1.39%，LMG的RSD为1.54%。结果表明，本法的重复性良好。

2.6 加标回收及精密度试验

称取已均质好的阴性样品，分别添加0.5、1.5、5 μg·kg-13个水平浓度MG、LMG标准溶液，按“2.2.6”进行制备，按“2.1”条件进行测定，结果见表2。

表2 样品加标回收率以及精密度表（n=3）

2.7 按照GB/T 19857-2005方法测定

称取已均质好的阴性样品，分别添加0.5、1.5、5 μg·kg-1MG、LMG3个水平浓度标准溶液，按GB/T 19857-2005方法进行测定，结果见表3。

表3 样品加标回收率及精密度表（n=3）

2.8 样品测定

取已匀浆的淡水鱼（罗非鱼、草鱼、大头鱼、鲫鱼）、海水鱼（大眼鱼、龙利鱼、泥猛鱼、花棍鱼、鲜活泥鱼）、虾（南美对虾、明虾、弹虾）、螺（红螺、花螺、白螺、圣子螺、玉米螺）和螃蟹（花蟹、花麻蟹、青蟹）各6批次，样品来源于抽检样品，按本方法处理测定，有2批有检出MG和LMG，其余均未检出MG和LMG。

3 讨论

3.1 提取和净化的选择

MG在水产品中主要以隐色代谢物LMG的形式存在，具有很强的亲脂性，水产品基质复杂，脂肪含量高，并不利于对目标化合物的提取和检测。目前各种氧化铝小柱可以去除样品中的脂肪。按照GB/T 19857-2005一直用乙腈活化后的中性氧化铝固相萃取净化，达到清除油脂，去杂质的作用。经过实验比较，发现用适量中性氧化铝进行除杂，可以达到消除油脂和基体的影响的良好效果。在同时达到消除杂质和油脂的影响，保护色谱柱和质谱仪的前提下，使用中性氧化铝小柱成本高，步骤多，而使用中性氧化铝成本较低，而且操作简便，适于大批量处理样品。

3.2 与GB/T 19857-2005方法比较

由实验结果可知，本法MG、LMG的回收率在84.1%～98.3%，相对标准偏差在0.1%～2.2%；国家标准GB/T 19857-2005方法MG、LMG的回收率在84.7%～108.3%，相对标准偏差在0.5%～1.7%。对比两个方法的回收率和相对标准偏差相差不大。

当阳性样品分别按本方法和GB/T 19857-2005处理并测定，两个测定结果相差并不大。阳性样品按照本方法处理测定，MG、LMG的平均回收率分别为101.3%、98.2%，相对标准偏差分别为0.6%、0.4%。按GB/T 19857-2005方法进行处理测定，MG、LMG的平均回收率分别为100.7%、98.5%，对标准偏差分别为0.6%、0.8%。比较两者的平均回收率和相对标准偏差相差不大，符合方法检测的要求。

3.3 结论

本方法在参考国家标准GB/T 19857-2005基础上，采用了HPLC-MS/MS同时检测鲜活水产品中孔雀石绿及其代谢物残留量。同时参考最近MG和LMG检测的文献[2]可知，其中检测的前处理过程，用到中性氧化铝小柱，柱子成本高，或需要进行氮吹步骤，耗时长，或需用到二氯甲烷，毒性大。本实验样品MG和LMG直接用乙腈提取，加中性氧化铝（100～200目）净化，简化前处理过柱步骤并节约实验耗材，省去氮吹步骤，缩短时间。在3个添加水平下的回收率、精密度良好，检出限低。用两个方法对阳性样品进行含量测定，测定结果相差不大，符合方法检测的要求。同时发挥液相色谱与串联质谱的优势，较好的对目标化合物进行定量和定性分析，达到高效、快速、操作简单、结果准确的效果，满足日常大批量样品检测的要求。