乳制品中维生素B1检测条件优化研究

2019-01-03陶大利

现代食品 2018年20期

◎ 陶大利，李琴，白鹤

（农业部乳品质量监督检验测试中心（哈尔滨），黑龙江哈尔滨 150090）

维生素B1（Vitamin B1）又称硫胺素，其分子包含一个嘧啶环和一个噻唑环，通过一个亚甲基连接而组成[1]。维生素B1是人体必不可少的一种水溶性B族维生素，具有保护人体神经系统、消化系统、心血管系统的作用，还能促进肠胃蠕动、增加食欲等[2]。目前，有关维生素B1的检测方法主要有高效液相色谱法[3]、荧光分光光度计法[4-5]、化学发光法[6]、液相色谱-串联质谱法[7]等。食品安全国家标准GB 5009.84-2016《食品中维生素B1的测定》采用高效液相色谱法，前处理采用衍生的方式用荧光检测器实现测定，但实际测定中发现，检测回收率始终偏低，仅为80%～85%，分析原因发现样品溶液中维生素B1的衍生程度低于标准品中溶液中维生素B1的衍生程度，导致回收率偏低。为此，本研究旨在对样品前处理的衍生条件进行了优化，使方法的检测准确度和精密度都有一定的提升。

1 实验部分

1.1 试剂与耗材

甲醇（色谱纯）、乙酸钠（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、正丁醇（色谱纯）、盐酸（优级纯）、氯化钾（分析纯）、木瓜蛋白酶（生化试剂）和维生素B1标准品。

衍生剂：称取1 g亚铁氰化钾，用一级水溶液转移至100 mL容量瓶中，定容混匀；移取5 mL亚铁氰化钾溶液于100 mL容量瓶，用140 g·L-1氢氧化钠溶液定容混匀即可，此时浓度为0.5 mg·mL-1亚铁氰化钾氢氧化钠（140 g·L-1）。

1.2 仪器

Waters2695高效液相色谱仪（配荧光检测器，waters公司）、ML204万分之一精密电子天平（梅特勒托利多）、3-30K高速冷冻离心机（SIGMA）、S40K酸度计（梅特勒托利多）、超纯水器（Thermo）、36D高压灭菌锅（厦门致微）。

1.3 样品前处理

（1）样品提取。奶粉称取5 g，液体奶称取15 g（精确到0.01 g）试样于100 mL棕色三角瓶中，加入0.1 mol·L-1盐酸40 mL充分混匀，放入高压锅中121 ℃灭菌30 min，取出冷却至室温，用2.0 mol·L-1乙酸钠溶液调pH值至4.0左右，加入2 mL木瓜蛋白酶溶液，置培养箱37 ℃培养过夜，将全部液体转移至100 mL容量瓶中，过滤备用。

（2）样品衍生。移取2 mL滤液于30 mL具塞离心管中，加入8 mL一级水、2.5 g氯化钾，混合均匀，加入5 mL衍生剂混匀，再加入10 mL正丁醇，振荡1 min，置离心机内4 000 r·min-1离心5 min，取上清液用0.45 μm有机滤膜过滤，上机测试。

（3）标准品衍生。配制一系列标准工作液，0.02、0.04、0.08、0.12、0.24 μg·mL-1和 0.36μg·mL-1，分别移取10 mL标准工作液于30 mL具塞离心管中，除不加水其他按样品衍生步骤操作。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18250×4.6 mm，5 μm液相色谱柱；流动相：0.05 mol·L-1乙酸钠溶液（pH4.5）+甲醇（70+30）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；波长：激发波长375 nm，发射波长435 nm；进样量：10 μL。

2 结果与分析

2.1 流动相比例的选择

国家标准采用0.05 mol·L-1乙酸钠溶液∶甲醇（65∶35体积比），在水与甲醇混合比例不同时，混合液的黏度会发生较大变化，在实际使用中当甲醇水比例为35%时，产生的柱压近20 684 kPa，长期高柱压会导致柱寿命的缩短。为此笔者对甲醇比例作了调整，经测试乙酸钠与甲醇的比例降至70∶30时，柱压可降至17 237 kPa，维生素B1衍生物的出峰时间也可以控制在10 min以内，且能实现与干扰物的分离，另外，提高柱温对降低柱压有促进作用，最终确定流动相为70∶30的乙酸钠、甲醇，柱温为40 ℃。样品与标样叠加谱图见图1（标样浓度0.03 μg·mL-1）。

图1 维生素B1标样与样品谱图叠加图

2.2 衍生条件的优化

取9 mL样品滤液加入1 mL 2μg·mL-1维生素B1标准中间液作加标样，另取9 mL样品滤液加入1 mL一级水作空白样，同时取1 mL 2 μg·mL-1维生素B1标准中间液加9 mL一级水作标准对照样，按国家标准方法操作，加入0.5 mg·mL-1亚铁氰化钾氢氧化钠（100 g·L-1）溶液5 mL，混匀，再加入10 mL正丁醇充分混匀，离心取上清液过0.22 μm滤膜，上机测试，样品峰面积见表1。由表1可以看出，相同浓度的维生素B1（0.2 μg·mL-1）在纯水中和样品中衍生的程度存在较大的差异。

表1 加标溶液比对表

针对此问题，本文对衍生过程中试剂的用量及操作条件做了研究，实验设计涉及的试剂和条件有亚铁氰化钾浓度变化、氢氧化钠浓度变化、衍生时间变化、取样量的变化这4个条件，分别对4个条件进行优化，改变其中一个条件，保持其他条件按国家标准方法不变，得到以下结果。

（1）亚铁氰化钾溶液浓度的变化。分别配制0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg·mL-1和 0.8 mg·mL-1亚铁氰化钾溶液，其他衍生条件按国家标准操作，维生素B1理论浓度0.2 μg·mL-1，结果见图2。由图2可以看出，衍生剂浓度在0.5 mg·mL-1，衍生后的荧光值最高，亚铁氰化钾浓度过高，可能会出现过度氧化导致荧光值下降。故亚铁氰化钾最佳浓度选择0.5 mg·mL-1。

图2 亚铁氰化钾变化趋势图

（2）氢氧化钠浓度变化。分别配制60、80、100、120、140 g·L-1和 160 g·L-1氢氧化钠溶液，溶解亚铁氰化钾，配制成亚铁氰化钾均为0.5 mg·mL-1，其他条件按国家标准方法操作，得到结果见图3，由图3分析，随着氢氧化钠浓度的增加，荧光值逐渐增加，到140 g·L-1时基本稳定，故氢氧化钠浓度选择140 g·L-1。

图3 氢氧化钠变化趋势图

（3）衍生时间变化。即加入亚铁氰化钾溶液后，放置时间的变化，分别设置1、2、4、6、8 min和10 min，其他按国家标准操作，发现不同的放置时间的样品峰面积没有明显的差异，说明衍生时间的变化对衍生的程度没有影响。

（4）衍生样品用量的变化。分别吸取1、2、4、6、8 mL和10 mL样品，再分别用一级水补足到10 mL，分别按国家标准方法衍生，得到的峰面积再折算成1 mL样液产生的峰面积，结果见表2。

表2 衍生样品用量对比表

由表2可以看出，样品的取样量越小，折算成1 mL样液衍生的峰面积越大，说明样品中的杂质干扰对维生素B1的衍生有一定的影响，降低样品的取样量有利于样品中维生素B1衍生的完全，当取样量为2 mL时，方法的检出限仍可以满足国家标准的要求。

由于维生素B1的衍生物用正丁醇提取，但提取后发现正丁醇稍浑浊，查找正丁醇化学性质，正丁醇微溶于水，这样就会使正丁醇与水溶液分离不够彻底，提取体积不够精确，同时考虑到衍生过程中使用高浓度氢氧化钠，也会使少量的氢氧化钠混入正丁醇中，如此进样会损伤色谱柱，降低色谱柱的寿命，利用盐析的原理在衍生过程中加入一定量的氯化钾，有利于正丁醇与水相的分层，使正丁醇更澄清。

综合以上优化的条件，最终确定取样2 mL，加入8 mL一级水、2.5 g氯化钾、0.5 mg·mL-1亚铁氰化钾氢氧化钠溶液（140 g·L-1）5 mL涡旋混匀，加入10 mL正丁醇充分振荡1 min，离心后取上清液过0.45 μm滤膜上机测试。采用新优化的衍生条件进行样品重复性测试见表3和加标回收试验见表4，经试验回收率在93.5%～98.0%，相对标准偏差RSD为2.69%（n=6）。