大鼠肾移植急性排斥反应过程中IL-17表达及其意义

滕昊林 于金宇 刘 念 赵 军 高宝山 薛立娟

(吉林大学第一医院泌尿外二科,长春 130021)

肾移植是治疗终末期肾病的有效手段之一，而急性排斥反应是肾移植术后最常见的并发症，随着对器官移植免疫研究的不断深入，临床针对移植排斥反应所采取的治疗措施也更加积极有效，因此有关移植的排斥反应机制及其预防和治疗，更加受到科研和临床医务工作者的重视。

IL-17主要由Th17细胞分泌，是一种前炎性细胞因子，它通过促进T细胞成熟和活化、炎细胞聚集、增殖抗原提呈细胞而在移植物局部炎症反应中发挥作用，参与急性排斥反应的发生发展[1，2]。

本研究使用近交系 SD 大鼠作为供体，Wistar 大鼠作为受体，建立肾移植急性排斥模型，于术后第3、5、7天分别切除移植肾，每组每天6只大鼠，切除的移植肾部分置于10%福尔马林溶液中固定、切片，随后行HE、Masson、PAS、PASM等染色，光镜下诊断急性排斥反应。然后通过RT-PCR扩增肾脏总RNA和对病理切片进行免疫组化的方法检测剩余肾脏组织中的IL-17。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 RT-PCR 两步法试剂盒、DNA Marker DL2 000、Trizol(均为日本 TaKaRa公司产品)，IL-17特异性一抗(大鼠)武汉博士德公司，免疫组化UltraSensitiveTMS-P 试剂盒(鼠/兔)，β-actin 218、IL-17引物(大连宝生物)。

1.2实验方法 将大鼠急性肾移植排斥反应模型分组：正常雄性Wistar大鼠肾脏为正常对照组(Control组)；Wistar大鼠作为供受者的同系基因对照组(STX组)；SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者的同种异体移植组(ATX组)；SD大鼠为供者，Wistar大鼠为受者，术后给予CsA的同种异体免疫抑制组(ATX +CsA组)。

每组在术后第3、5、7天获得6只移植肾，部分置于10%福尔马林溶液中固定、切片，剩余部分处理，液氮中冻存。大鼠移植肾mRNA按照试剂盒要求提取。逆转录与聚合酶链反应(RT-PCR)，参照试剂盒要求。取20 μl PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳，0.5%溴化乙锭染色 20 min。凝胶成像分析系统拍照及电泳条带的强度分析，计算每一条目的片段与β-actin 218片段的强度比值，用来表示该目的基因的相对表达水平。

免疫组化染色及结果的判定，按照试剂盒说明书要求。所有切片在光学显微镜下观察，以集合系统上皮细胞膜有棕褐色染色者为阳性细胞,通过图像分析测得阳性细胞的灰度值(IOD 值)作为 IL-17蛋白的相对表达量进行分析比较。

2 结果

2.1移植肾IL-17 mRNA表达特点 大鼠术后第3、5、7天移植肾组织IL-17 mRNA表达详见表1，其结果表明，ATX组在第3、5、7天移植肾IL-17 mRNA均明显升高，与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05),其中以第5天为最高(P<0.05)，具有统计学意义。而STX组和ATX+CSA组第3、5、7天移植肾IL-17 mRNA表达与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1～3。

2.2移植肾IL-17免疫组化表达特点 大鼠组术后第 3、5、7天移植肾免疫组化结果，与正常对照组相比，ATX组大鼠术后第3、5、7天均出现不同程度的急性排斥反应，移植肾IL-17 IOD值均显著升高(P<0.05)， 以术后第5天移植肾IL-17 IOD值为最高，与术后第3天和第7天相比均有统计学意义(P<0.05)。STX 组、ATX+CsA 组大鼠移植肾术后第3、5、7天IL-17 IOD 值的变化与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)。见表2,图1～3。

表1第3、5、7天IL-17mRNA相对表达量表达

Tab.1RelativeexpressionofIL-17mRNAatday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control0.895±0.1140.731±0.0530.590±0.142STX0.923±0.1280.757±0.0850.685±0.069ATX1.431±0.0361)1.741±0.0961)1.221±0.0891)ATX+CSA0.916±0.1180.830±0.0460.702±0.040

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

图1 肾移植术后第3天各组IL-17免疫组化检测结果(×200)Fig.1 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 3rd day after renal transplantation (× 200)

图2 肾移植术后第5天各组IL-17免疫组化检测结果(×200)Fig.2 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 5th day after renal transplantation (× 200)

图3 肾移植术后第7天各组IL-17免疫组化检测结果(×200)Fig.3 Immunohistochemical results of IL-17 in each group 7th day after renal transplantation (× 200)

表2第3、5、7天IL-17免疫组化IOD值

Tab.2IODvaluesofIl-17immunohistochemicalonday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control6 493.07±1 259.17 6 317.34±1 094.476 521.22±1 147.80STX6 745.04±2 359.28 7 012.24±1 973.126 938.51±2 146.79ATX9 241.19±1 153.621)11 896.17±134.831) 9 587.68±1 306.421)ATX+CSA6 198.42±1 069.856 587.59±1 530.806 387.31±1 429.16

Note：Compared with the control group，P<0.05.

3 讨论

早期急性排斥反应是影响移植肾长期存活和失功的重要危险因素之一[3,4]，找到一种能在早期监测移植功能状态及其预后的指标，是移植免疫学的重要工作和研究热点。IL-17是具有多种功能的前炎性细胞因子，通过与其受体结合，促进多种炎性细胞因子释放，参与机体的免疫反应[5-7]。

在以往的大鼠肾移植模型研究发现，肾移植后第1天血清中IL-17水平出现增长，第2天开始在移植肾浸润的单核细胞内检测出明显表达升高的IL-17，高峰期多出现在第5天[8,9]，本研究亦发现在ATX组的术后第3天、5天和7天移植肾IL-17表达均明显升高，与对照组相比，均有统计学意义，尤以第5天表达最显著，此结果与文献报道相符。

越来越多的数据证实，IL-17直接或间接在细胞和体液免疫中参与肾移植急性排斥反应的发生[10-12]，部分结果表明肾移植术后发生急性排斥反应时升高的IL-17是早期独立预测因子，与移植肾预后有关[13]。由此可见IL-17在大鼠免疫排斥反应模型中，早期即可出现，可以作为早期排斥反应的预测指标。

本研究通过检测大鼠肾脏移植排斥模型中IL-17在术后表达情况的变化，分别比较了大鼠排斥模型术后第3、5、7天的表达，对排斥反应发生时IL-17表达与移植肾急性排斥反应的相关性及临床意义进行了阐述，在后续的进一步研究中，我们力图探讨IL-17表达与体液排斥反应及不同病理分级分期阶段的特点和意义，为肾移植术后诊断和防治急性排斥反应的发生发展及其预后判断提供新的实用指标。