MYH9基因Rs4821480位点单核苷酸多态性与IgA肾病病理及预后关系研究

田园青 张悦凤 王彩丽

(天津市海河医院，天津 300350)

IgA 肾病(IgA nephropathy，IgAN)是以反复发作性肉眼血尿或镜下血尿，肾小球系膜区 IgA 沉积或以 IgA 沉积为主要特征的原发性肾小球疾病[1]。大部分观点认为IgA在系膜沉积，活化补体，产生炎症反应，该病与黏膜感染(呼吸道、肠道等)有关，与免疫和遗传因素亦有一定相关性，可发生在任何年龄，伴有不同程度的蛋白尿、高血压和肾脏功能受损，是导致终末期肾脏病的常见原发性肾小球疾病 。

IgAN是最常见的与6q22-23相关的肾小球肾炎[2]，是一种多基因疾病，人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)位于人类第 6 号染色体短臂 6p21.3区域，有研究认为系膜增生性IgAN与HLA-DRB1 基因多态性相关[3]。非肌性肌球蛋白重链9基因(Myosin heavy chain 9,nonmuscle,MYH9)位于人染色体22q12.3，被证实与非裔美国人慢性肾脏病相关[4,5](Chronic kidney disease，CKD)，包括局灶性节段性肾小球硬化症[4,5](Focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)、糖尿病(2型)肾病[6]、C1q肾病[7]和高血压肾损害[5]等。本文通过PCR技术探讨MYH9Rs4821480位点基因多态性与病理、预后关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 IgAN组：肾穿刺活检诊断为IgAN患者148例,并随访。

1.2实验方法 外周静脉血提取DNA，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，MYH9基因总序列(chromosome:NCBI36:22:35006673:35114558:-1)上游引物5′-GCCACACAGAACAGAAAGC-3′，下游引物5′-GGCTGGCATTTAGTGTTGG-3′。扩增产物440 bp，酶切位点A、T。扩增条件： 94℃预变性180 s，94℃变性35 s，55℃退火45 s，72℃延伸55 s，共30个循环。72℃终末延伸10 min。酶切体系： PCR产物10 μl, DraⅠ内切酶0.5 μl、缓冲液2 μl、双蒸水7.5 μl,370℃ 温育箱过夜(12～13 h)，2%琼脂糖4.0 g/dl溴乙锭凝胶方法电泳(电压120 V,20 min)，紫外透射自动成像分析仪上进行成像。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0软件，计量资料采用独立样本t检验(Independenttest)和单项方差分析(One-Way ANOVA),计数、等级资料比较采用χ2检验(Chi-Square test)，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验，多因素生存分析采用Cox模型，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PCR扩增产物电泳结果 PCR扩增目的片段440 bp，酶切：①TT纯合子，300 bp；②GT杂合子，440 bp、300 bp；③GG纯合子，440 bp(图1)。

2.2病理指标比较 计量资料肾病理免疫荧光IgA、C3，病理Hass分级在三种基因型间差异无统计学意义(表1、2)。

2.3基因型对肾功能影响分析 根据CCR水平(CCR<60 ml/min以及CCR≥60 ml/min)分组后作为应变量，将发病时年龄、基因型、Haas分级、血压、蛋白尿程度等分别赋值作为自变量进行logistic回归分析。结果表明年龄是肾脏损害加重的独立危险因素(P=0.012,OR=1.375)(表3)，基因型则与肾功能进展无关。

图1 基因型产物电泳图Fig.1 Electrophoretic map of genotypic productsNote: M.Marker(150 bp，240 bp，400 bp)；1，2.TT(300 bp)；3，4.GT(440 bp，300 bp)；5，6.GG(440 bp).

2.4基因型与预后的相关性分析 对148例患者进行随访，以肾穿为零点，CCr<15 ml/min或SCr增倍为终点事件。进行Kaplan-Meier生存分析整体比较(图2)。TT基因型下降明显(表4)；基因型组两两比较，GG基因型与TT基因型差异有统计学意义(表5)。

图2 Kaplan-Meier生存分析Fig.2 Kaplan-Meier survival analysisNote: X10=Genotype，1=GG，n=14，2=GT n=39，3=TT n=3.

表1计量资料描述性比较

Tab.1Descriptivecomparisonofmeasurementdata

Measurement data GenotypeGG(n=30)GT(n=107)TT(n=11)Pathological immunofluorescence IgA2.48±0.672.70±0.672.63±0.52Pathological immunofluorescence C31.86±0.991.89±1.141.75±0.89

Note：One-way ANOVA analysisP>0.05.

表2等级资料比较

Tab.2Gradedatacomparison

Count grade dataGenotypeGGGTTTSex Male16527 Female14554Hematuria No493 Yes26755Hass pathological grade Level 1,210306 Level 3,4,52074524 proteinuria <1 g5253 ≥1 g 2067724 h proteinuria<1 g52531 g≤24 h proteinuria<3.5 g1244324 h proteinuria≥3.5 g8234

Note：Chi-Square test，P>0.05.

表3Logistic回归统计结果

Tab.3Logisticregressionstatistics

Variable(B)(S.E.)WaldSig.Exp(B)95%CI for Exp(B)LowerUpperAge1.3360.5346.2700.0121)3.8041.33710.827Sex0.4260.6300.4580.4981.5320.4465.263Blood pressure0.4120.6980.3480.5551.5100.3845.935Urine protein0.6440.4462.0830.1491.9050.7944.570Hematuria 0.9620.6282.3470.1262.6170.7648.963HASS0.2820.3010.8790.3481.3250.7352.389Genotype0.3190.6060.2770.5991.3750.4194.509

Note：1)P=0.012<0.05.The confidence interval for correcting the regression coefficient 95% does not contain 1.

表4生存分析描述

Tab.4Survivalanalysisdescription

GenotypeNumber of each groupNumber of events atthe end pointCensored value (truncated value)Number of casesPercentage (%)GG1421285.7GT3973282.1TT32133.3Total56114580.4

表5生存时间两两比较

Tab.5Comparisonofsurvivaltime

GenotypeGGχ2(Log-Rank)PGTχ2(Log-Rank)PTTχ2(Log-Rank)PGG0.6890.4064.1060.0431)GT0.6890.4063.6200.057TT4.1060.0431)3.6200.057

Note：1)P<0.05.

表6Cox模型筛选的危险因素及参数估计

Tab.6RiskfactorsandparameterestimationofCoxmodelscreening

VariableBSEWaldSig.Exp(B)95.0% CI for Exp(B)LowerUpperAge-12.4066.1924.0140.0451)0.0000.0000.764Sex-1.6352.9830.3000.5840.1950.00167.473Blood pressure-2.0513.8310.2860.5920.1290.000234.736Urine protein-5.8257.2700.6420.4230.0030.0004 551.996Hematuria -3.4143.3181.0580.3040.0330.00021.979HASS-2.6101.1455.1950.0231)0.0740.0080.694CCR-4.6871.8016.7700.0091)0.0090.0000.315Genotype0.3704.8800.0060.9401.4470.00020 639.818

Note：1)P<0.05.

多因素对预后影响采用Cox比例风险模型进行分析，将对预后有影响的可能危险因素：发病年龄、CCR水平、蛋白尿程度、血压、Haas分级、不同基因型等分别赋值作为自变量，得出结论：发病时年龄、CCR水平、Hass分级是影响肾病患者预后的独立危险因素(P<0.05)(表6)。

3 讨论

IgAN是由法国Berger于1968年首次提出的一种原发性肾小球疾病，最早认为预后良好，经过40余年研究发现，IgAN是一种慢性进展性疾病，20%～40%进展为终末期肾病，该病是由免疫复合物介导的肾小球肾炎，共同特征是免疫荧光下见到IgA在系膜区或伴沿毛细血管壁沉积[8]，可合并IgG、IgM及补体沉积。不同种类的免疫球蛋白沉积与临床表现及组织损伤程度之间有一定的关系。单纯IgA型组织损伤程度较轻，合并IgG及/或IgM沉积者,易合并补体沉积,提示其结合补体能力较单纯IgA沉积强,因此造成肾组织相应损伤也较重,IgG、IgM及补体的沉积,可能参与IgAN的发生和发展[9]。然而迄今为止未找到与IgA抗体起反应的抗原物质，但治疗上仍以抑制补体活化治疗该病。IgAN临床表现和预后多种多样[10]，其发病机制尚不清楚，疾病进展速度与性别、年龄、是否合并肾性高血压、尿蛋白程度均有一定的相关性，其中尿蛋白水平与 IgAN进展最为密切，其治疗时应用激素或免疫抑制剂等也一定程度上参考蛋白尿水平，降低 IgA肾病患者的蛋白尿可以改善预后[11]。

IgAN肾活检病理变化多样，轻者光镜下肾小球、肾小管基本正常，重者肾小球出现严重坏死性病变、新月体形成；肾小球硬化和肾小管萎缩/间质纤维化[12]，发展为临床终末期肾病(ESRD)。不同病理分型的IgAN预后差异很大[13]。病理学家提出多种分类方法，但有一定局限性，未能获得广泛认同。目前较广泛的IgAN分级系统包括WHO组织学分类法、Lee、Hass 分类法。目前国际上还没有一个分级系统广为临床和病理医生所接受，对各种病理改变的临床意义还缺乏统一的认识，各个分级之间也很难达成一致。 国际 IgAN协作组和肾脏病理学会于2009 年建立了牛津病理分级标准。牛津病理分型方法强调 IgAN常见的病理指标，容易评估，较客观反映肾活检肾脏病变的动态变化，具有高度可重复性[14]，具备了将不同中心、不同病理医师所得病理结果进行比较的基础，各个病理指标与 IgAN临床指标独立相关[15]。但牛津分型是回顾性研究，病例选择存在偏倚，中国病例数偏少，其合理程度及可操作性需进一步验证。 Hass 分型属于描述性分级，有研究结果提示 Hass分型级数越高，临床肾功能越差，分级结果与临床实验室的检查吻合度较高[16]。Hass 与 WHO分级方法的一致性较好[17]。结合以上，我们选择Hass分级进行数据统计分析。

肾小球机械屏障滤孔由内层是毛细血管的内皮细胞、中层是非细胞性的基膜、外层是肾小球的上皮细胞组成，上皮细胞具有足突细胞，相互交错的足突之间形成裂隙。裂隙上有一层滤过裂隙隔膜，是滤过的最后一道屏障。足突细胞及其相关的裂孔膜蛋白在蛋白尿发生和进展中发挥重要作用，受到国内外的重视[18]，Ghiggeri等[19]研究发现个体MYH9基因突变，肾活检电镜表现为局灶足细胞足突消失，足细胞裂孔隔膜缺失，足细胞受损。MYH9基因编码非肌性肌球蛋白重链ⅡA (Nonmusclemyosin heavy chain ⅡA ,NMMHC-ⅡA) ，分子量约220 kD，主要在肾小球(特别是足细胞)、肾小管和小管周围毛细血管表达,在近曲小管呈弥散分布，定位于肾小球足细胞和系膜细胞异常肌球蛋白聚集、破坏足细胞和肾小管上皮细胞细胞骨架，导致肾脏疾病进展， 有研究发现正常肾组织中 MYH9 不表达[20]。

但是我们通过研究MYH9基因Rs4821480位点基因多态性发现其基因型与IgAN病理HASS分级、病理指标、蛋白尿、镜下血尿无关，考虑原因为该位点基因突变对足细胞的影响较小，但这只是推测，有待于加大样本量进一步研究。对随访患者进行Kaplan-Meier生存分析比较，TT基因型下降明显，生存时间比较，GG基因型与TT因型有统计学差异，这说明T等位基因可能引起肾功能恶化。这说明该基因多态性可能与肾脏疾病相关，直接导致肾脏疾病进展[4,5]。

IgAN的临床病程与预后极不平衡，研究认为大量蛋白尿与血肌酐升高是不良预后的独立危险因素，若IgAN表现为肾病综合征、大量蛋白尿，或伴随肾性高血压，新月体形成，那么预后极为不佳，同时，严重的肾小球硬化与间质纤维化是病程进展的独立危险因素[21]。

本研究发现该基因位点年龄、CCR、Hass分级与IgAN预后有关，与既往研究相同，但是MYH9基因该位点基因型与预后无明显相关。 近期也有研究发现该基因SNP 并未见与ESRD有显著关联[22]，该研究结果与我国其他研究相似[23]需加大样本量及随访量进一步研究。