丹参提取物对高血压性心脏病大鼠神经免疫的调节作用初探

吴应强 叶久茂 范腾阳 吴进霞 陈小燕

(遵义医学院附属医院全科医学科,遵义 563000)

高血压以动脉血压增高为主要特征，可并发脑、心脏、血管和肾脏等靶器官功能损伤，致死率较高[1]。高血压性心脏病(Hypertensive heart disease，HHD)是由高血压引起的心脏靶器官损害，主要表现为左心室受损、左心室肥大等临床症状[2]。HHD患者若不及时治疗，病情不断恶化和加重，会导致左心衰竭。目前，HHD发病机制仍未完全阐明，但研究者认为神经、内分泌及免疫系统功能紊乱是导致发病的重要原因[3,4]。因此从神经免疫调节进行深入探究可望成为临床治疗HHD的新策略。针对HHD的防治，中药在改善临床症状，减少并发症，副毒作用相对较轻等方面具有一定的优势。丹参具有保护血管内皮细胞和心肌、抗心律失常、提高心肌耐缺氧能力、抗氧化和清除自由基和抗炎等作用，被用于治疗心脑血管、癌症等疾病。本研究通过建立HHD大鼠模型，并注射不同浓度丹参乙醇提取物溶液，初步探讨丹参提取物对HHD大鼠神经免疫的调节作用。

1 材料与方法

1.1材料 50只清洁级雄性SD大鼠，体重200～260 g，购自上海市医学实验动物中心，饲养环境：温度20～27℃，相对湿度45%～75%，噪音85分贝以下，12 h光照、12 h黑暗，通风换气8～12次/h，自由进食和饮水，实验动物许可证号：SCXK 20170008。

1.2方法

1.2.1HHD大鼠模型制备 随机取40只大鼠HHD模型采用结扎腹主动脉法，称量大鼠体重，按1.0 mg/kg腹腔注射25 g/L水合氯醛麻醉。麻醉后仰卧位固定，从腹前正中纵向开约1.5～2 cm切口，小心钝性分离使腹主动脉暴露，取用直径1.7 mm探针结扎到腹主动脉，缓慢抽出探针后，形成腹主动脉狭窄(约50%狭窄)，在腹腔注射10 U/ml青霉素防止感染，之后关腹缝合。造模1周后检测大鼠心功能和血压，若左心室收缩末期内径(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)>10 mm，舒张末期内径(Left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)>8 mm，动脉收缩压(Systolic blood pressure,SBP)>150 mmHg、舒张压(Diastolic blood pressure,DBP)>120 mmHg，则表示造模成功。

1.2.2分组及干预方法 将造模成功的SD大鼠随机分为A组、B组、C组和D组，每组10只，未造模的10只大鼠记为对照组。A组和对照组腹腔注射生理盐水5 ml，B组、C组和D组分别腹腔注射0.75 ml/mg、1.5 ml/mg、3.0 ml/mg各5 ml丹参乙醇提取物溶液，每周称重1次，根据体重调整药量，每周注射1次，注射持续4周。

1.2.3心功能和血压指标检测 注射4周后，仰卧位固定大鼠，剪净左前胸毛，使用频率 10.0 MHz探头心脏超声诊断仪进行心功能检测检查，连续测量3个不同心动周期LVESD及LVEDD，取平均值，并计算左心室射血分数(Left ventricular reject fraction,LVEF)。

采用尾动脉无创性血压测量动脉SBP、DBP，固定盒固定后放入固定架，在接近尾根部通过加压套插入血压测量仪，调节鼠尾压迫片使传感片紧贴尾动脉，待大鼠脉搏稳定后进行测量。

1.2.4神经因子指标检测 注射结束12 h后，取各组大鼠外周血5 ml，3 000 r/min 4℃离心15 min 取上清，存于-80℃冰箱待检。采用酶联免疫试剂盒法(ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201608072)测定血浆中 P物质(Substance P,SP)、血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)、去甲肾上腺素(Noradrena-line,NE)、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin,AngⅡ)水平，每孔加入待测样本10 μl，37℃温育30 min，洗涤4次后，加入酶标工作液50 μl，温育洗涤，加入显色剂各50 μl，避光显色15 min，再加入终止液50 μl，终止反应。450 nm波长测量各孔吸光度值(OD)，绘制标准曲线，计算3种神经因子水平。具体操作按照试剂盒说明书。

1.2.5免疫因子指标检测 注射结束12 h后，采集大鼠外周血5 ml，3 000 r/min 4℃离心15 min 取上清，采用ELISA法定量测定血液中白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)水平，具体操作同1.2.4，均借助酶联免疫试剂盒法(ELISA检测试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，生产批号：201608072)完成操作。采用流式细胞术检测外周血液自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)、T淋巴细胞亚群(T cell subset)CD4+、CD8+活性，并计算CD4+/CD8+比值。

1.2.6观察指标

1.2.6.1心功能和血压指标对比，包括LVEDD、LVESD、LVEF、SBP、DBP。

1.2.6.2神经因子指标对比，包括SP、VIP、NE、AngⅡ水平。

1.2.6.3免疫因子指标对比，包括IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+水平。

2 结果

2.1心功能和血压指标对比 对照组、A、B、C、D组LVEDD、LVESD、LVEF、SBP、DBP比较有显著性差异(P<0.05)。A、B、C、D组LVEF显著高于对照组(P<0.05)，LVEDD、LVESD、SBP、DBP显著低于对照组(P<0.05)；B、C、D组LVEF显著高于A组(P<0.05)，LVEDD、LVESD、SBP、DBP显著低于A组(P<0.05)；C、D组LVEF显著高于B组(P<0.05)，C、D组LVEDD、LVESD、SBP、DBP显著低于B组(P<0.05)；D组LVEF显著高于C组(P<0.05)，LVEDD、LVESD、DBP显著低于C组(P<0.05)。见图1～5所示。

2.2神经因子指标对比 如表1所示，对照组、A、B、C、D组SP、VIP、NE、AngⅡ比较差异有统计学意义(P<0.05)，A、B、C、D组SP、VIP显著高于对照组(P<0.05)，NE、AngⅡ均显著低于对照组(P<0.05)，B、C、D组SP、VIP显著高于A组(P<0.05)，NE、AngⅡ均显著低于A组(P<0.05)；C、D组SP、VIP显著高于B组(P<0.05)，NE、AngⅡ均显著低于B组(P<0.05)；D组(P<0.05)显著高于C组，NE、AngⅡ均显著低于C组(P<0.05)。

2.3免疫因子指标对比 如表2所示，对照组、A、B、C、D组IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+比较差异有统计学意义(P<0.05)，A、B、C、D组IL-10、NK、CD4+/CD8+显著高于对照组(P<0.05)，TNF-α显著低于对照组(P<0.05)；B、C、D组IL-10、NK、CD4+/CD8+显著高于A组(P<0.05)，TNF-α显著低于A组(P<0.05)；C、D组IL-10、NK、CD4+/CD8+显著高于B组(P<0.05)，TNF-α显著低于B组(P<0.05)；D组IL-10、NK、CD4+/CD8+显著高于C组(P<0.05)。

图1 LVEDD比较Fig.1 Comparison of LVEDD

图2 LVESD比较Fig.2 Comparison of LVESD

图3 LVEF比较Fig.3 Comparison of LVEF

图4 SBP比较Fig.4 Comparison of SBP

GroupsnSP(pg/L)VIP(pg/L)NE(ng/ml)AngⅡ(pg/ml)A group10275.64±18.2018.54±3.2144.02±2.21170.41±10.12B group10453.13±25.021)26.05±5.131)39.14±1.871)143.17±9.811)C group10594.05±24.311)2)28.17±4.101)2)36.20±1.011)2)131.56±7.151)2)D group10542.12±26.181)2)3)38.89±6.241)2)3)34.85±1.241)2)3)124.38±6.241)2)3)Control group10214.74±12.511)2)3)4)14.32±3.011)2)3)4)50.72±2.981)2)3)4)198.52±12.311)2)3)4)F729.74153.26761.82562.319P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the A group,1)P<0.05;compared with the B group,2)P<0.05;compared with the C group,3)P<0.05;compared with the D group,4)P<0.05.

GroupsnIL-10(pg/ml)TNF-α(ng/ml)NK(%)CD4+/CD8+A group1026.86±6.142.78±0.1914.17±1.241.23±0.08B group1034.13±6.831)1.76±0.151)19.58±1.191)1.36±0.141)C group1042.35±7.111)2)1.61±0.111)2)21.49±1.221)2)1.52±0.101)2)D group1051.64±6.971)2)3)1.50±0.141)2)23.73±1.181)2)3)1.69±0.121)2)3)Control group1022.41±5.181)2)3)4)2.96±0.191)2)3)4)10.73±1.051)2)3)4)1.00±0.071)2)3)4)F23.541159.743222.18663.174P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the A group,1)P<0.05;compared with the B group,2)P<0.05;compared with the C group,3)P<0.05;compared with the D group,4)P<0.05.

图5 DBP比较Fig.5 Comparison of DBP

3 讨论

HHD是高血压晚期的一种并发症，其主要是收缩压升高，心室壁压力负荷，导致左心室心肌舒张性功能不全，心室肥厚等心功能障碍症状。近年来，研究者从神经免疫调节方面对HHD发病机制进行探讨，认为与神经内分泌改变有关，如神经因子、IL-10、TNF-α表达水平、T淋巴细胞群活性与血压和心脏功能相关。研究发现某些神经内分泌细胞分泌的细胞因子，既可作用于神经内分泌系统，又对免疫系统有影响，共同参与机体调节[5]。T淋巴亚细胞群反映了机体的免疫功能，同时免疫细胞也可分泌多种神经肽和激素等作为免疫递质。因此，神经免疫递质、内分泌激素和细胞因子作为信息联系的关键因素，越来越受到关注。HHD多采用口服西药治疗，但是大多均为合成药，毒副作用较大，而中医药强调治病求本，减少并发症，并且毒副作用较轻，因此被广泛被用来治疗HHD。丹参提取物是从丹参根或根茎中获得，其味苦，性微寒，是常用中药，药理作用为能够扩张血管、改善微循环，提高心肌组织摄氧能力，利于改善心肌功能等。研究发现丹参提取物可逆转高血压导致的心室重构，改善冠状动脉粥样硬化心脏病患者左心室功能作用[6]。本研究通过对对照组、A、B、C、D组HHD大鼠血压指标和心功能指标检测发现，与对照组比较，A、B、C和D组均显著改善，且与A组比较，B、C、D组均显著改善(P<0.05)，且随丹参提取物浓度升高，疗效越好，说明丹参提取物对HHD大鼠血压和心功能有改善作用。史国娟等[7]丹参提取物丹参酮治疗大鼠高血压发现，丹参能够通过改善高血压患者血小板活化功能和血液流变来降低血压，并对神经活动有影响。因此，丹参乙醇提取物对HHD有疗效，能够降低血压和改善心脏功能。

SP是神经调节中信息传递的重要活性物质，直接调节心血管活动，能引起冠状动脉扩张，低浓度引起动脉痉挛，研究发现急性心肌缺血再灌注大鼠体内SP含量显著低于正常大鼠水平[8]。VIP是最常见的肽类神经递质之一，对心肌和血管有调节作用，如扩张血管、降低血压、加快心率和增强心肌收缩力等作用[9]。NE对血管有收缩作用，同时促进心肌细胞肥大，AngⅡ通过直接收缩血管导致血压升高，同时引起心血管系统重建而导致心肌肥大、心肌纤维化等[10]。本研究通过对对照组、A、B、C、D组神经因子SP、VIP、NE、AngⅡ水平检测发现，与对照组比较，A、B、C和D组SP、VIP均显著升高(P<0.05)，NE、AngⅡ均显著降低(P<0.05)，与A组比较，B、C、D组SP、VIP均显著升高(P<0.05)，NE、AngⅡ均显著降低(P<0.05)，且D组效果最好，说明丹参提取物能够影响SP、VIP、NE、AngⅡ水平。丹参可抑制血管平滑肌细胞合成，阻止心肌成纤维生成，降低氧自由基损害，保护血管内皮细胞，从而保护心功能，同时能够扩张血管，降低外周阻力，改善心肌缺血。心脏神经系统发挥作用主要与心脏神经递质的释放有关，SP、VIP、NE、AngⅡ均属相关因子[11]，因此推测丹参乙醇提取物通过局部SP、VIP来提高心脏壁神经元兴奋性，并通过抑制NE、AngⅡ水平，促进心肌运动，进而达到改善心功能和降低血压的目的。但丹参如何影响神经因子SP、VIP、NE、AngⅡ水平具体机制尚未明确。

本研究通过对对照组、A、B、C、D组炎症反应因子IL-10、TNF-α、NK、CD4+/CD8+检测发现，与对照组比较，A、B、C和D组炎性因子TNF-α显著降低(P<0.05)，IL-10、NK、CD4+/CD8+均显著升高(P<0.05)，与A组比较，B、C、D组炎性因子TNF-α显著降低(P<0.05)，IL-10、NK、CD4+/CD8+均显著升高(P<0.05)，且D组效果最好，说明丹参提取物能影响炎性因子IL-10、TNF-α水平和NK、CD4+/CD8+活性。赵满等[12]对丹参滴丸联合瑞舒伐他汀治疗急性心肌梗死的效果研究，发现与瑞舒伐他汀对照组相比，TNF-α水平均显著降低，IL-10水平显著改善，说明丹参对炎症免疫因子有一定的影响作用。研究认为与心功能有关的细胞因子可以作为炎症介导的细胞因子如促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1等和免疫调节抗炎因子IL-10等，心功能发生障碍时此类炎症因子表达水平升高[13，14]。NK细胞和T淋巴细胞亚群是在免疫平衡发挥作用，CD4+/CD8+比例表示机体免疫系统的稳定性，比值升高，表示免疫亢进[15]。丹参具有调节免疫力，改善身体功能的作用，本研究发现丹参提取物能有效降低炎性因子水平，而抗炎因子和免疫能力升高，所以推测丹参可能通过改善血管内皮功能，扩张血管，降低炎症因子TNF-α水平，增加抗炎因子IL-10和NK、CD4+/CD8+免疫活性，进而降低血压和改善心脏功能。

综上所述，通过本研究发现丹参提取物对HHD大鼠有改善心脏功能和降低血压作用，推测很可能是通过降低神经因子NE、AngⅡ水平和免疫因子TNF-α水平，提高SP、VIP、IL-10因子水平和NK、CD4+/CD8+免疫活性发挥作用。另外本实验未对丹参与信号转导通路和神经免疫相关蛋白调节机制深入研究，可作下一步探讨。