茯苓多糖抑制甲醛诱导小鼠血清DNA加合物的实验研究①

张志军 黄雪梅 胡昌军

(湖南医药学院检验医学院，怀化 418000)

茯苓又称玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟，为多孔菌科卧菌属真菌的干燥菌核，形如甘薯，球状，外皮淡棕色或黑褐色，内部粉色或白色。茯苓味甘淡，性平，有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功能。我国食用茯苓已有长达千年的历史，其功效广泛，与多种药材相配均能发挥其药效，是一种重要的中药药材。茯苓多糖(Pachymaran)是从茯苓中提取的生物活性物质，由葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖等成分组成，具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫调节等药理作用[1,2]。有研究发现，复方茯苓多糖口服液有抑制小鼠 S180 和 H22 肿瘤生长的作用，对实体瘤有显著抑制作用，能增强巨噬细胞吞噬功能，促进小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活性，调节荷瘤小鼠免疫功能[3]。有研究表明，羧甲基茯苓多糖能够有效逆转 TNF-α调控的体外 Caco-2 细胞系生物学特性，有可能是治疗炎症性肠病的潜在有效药物[4]。DNA加合物(DNA adducts)是亲电性的化合物或其代谢产物与生物体内DNA形成的共价结合产物，是DNA化学损伤最重要和最普遍的形式。目前认为，外源化合物与DNA发生共价结合，形成的结合物一旦逃避自身的修复，就可能导致某些特异位点的基因突变，因此DNA加合物的形成被认为是致肿瘤过程的一个重要阶段。它既可以作为分子水平暴露生物标志物来反映毒物到达靶部位的接触剂量，又可以作为一种效应标志物，反映DNA受到有毒化学物质损伤的效应程度。因此，抑制DNA加合物形成，对预防肿瘤的发生、保护机体健康有积极的效应。为进一步挖掘茯苓的药用价值，本研究用ELISA法分析茯苓多糖对甲醛诱导小鼠DNA加合物含量的影响，以探讨茯苓多糖的抗遗传损伤效应。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器 茯苓多糖提取物(西安开来生物工程有限公司，茯苓多糖含量63.5%，临用前用生理盐水溶解稀释至所需浓度)；甲醛(分析纯，临用前用生理盐水配制成所需浓度)；DNA加合物检测ELISA试剂盒(上海易利生物科技有限公司)；RT-6000酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；TD24-WS低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.1.2实验动物及分组 40只成年健康昆明种雄性小鼠由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供[许可证号为SCXK(湘)2009-0002，合格证号20-011]，体重20 g左右。用随机方法将其分成阳性对照组(甲醛染毒)、茯苓多糖低剂量组(甲醛+2 g/L茯苓多糖)、茯苓多糖中剂量组(甲醛+4 g/L茯苓多糖)和茯苓多糖高剂量组(甲醛+8 g/L茯苓多糖)共4组，每组10只。

1.2方法 小鼠先在通风及光照良好的实验室适应性饲养，普通饲料，自由饮食及摄水，实验室温度为18～24℃，湿度为30%～40%，每晚7点喂食一次，每两日更换一次饮水与垫料，饲养4 d后用于实验。阳性对照组小鼠灌胃0.4 ml浓度为0.5 g/L的甲醛溶液，各茯苓多糖组小鼠灌胃0.2 ml浓度为1.0 g/L的甲醛溶液和0.2 ml不同浓度的茯苓多糖溶液(低剂量组2.0 g/L，中剂量组4.0 g/L，高剂量组8.0 g/L)，各组小鼠每次灌胃量均为0.4 ml，持续灌胃7 d后(阳性对照组死亡2只，茯苓多糖低剂量组死亡1只)摘眼球取血，1 500 r/min离心3 min分离血清，用ELISA法测定各组小鼠血清DNA加合物含量。

ELISA法(试剂盒)操作主要流程：①标准品稀释。②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50 μl，待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。③温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min。④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。⑥加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。⑦温育与洗涤：操作同前。⑧显色：每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min。⑨终止：每孔加终止液50 μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。⑩测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定在加终止液后15 min以内进行。

1.3统计学处理 数据用SPSS11.0统计软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

茯苓多糖对小鼠血清DNA加合物浓度有影响，4组间DNA加合物浓度差异有统计学意义(Kruskal Wallis Test，H=28.354，P<0.01)。茯苓多糖可减少DNA加合物的形成，且有剂量-效应关系，茯苓多糖剂量越高，DNA加合物浓度越低，小鼠血清DNA加合物浓度与茯苓多糖剂量呈负相关(Spearman等级相关系数rs=-0.869，P<0.01)。结果见表1。

3 讨论

DNA加合物是近年来备受关注的除DPC(DNA蛋白交联物)之外的另一类生物大分子的重要遗传损害标记物，是环境理化因素对生物大分子物质的一种重要遗传损害，它的形成可影响基因的表达，破坏染色体的正常结构，导致DNA复制过程中某些重要遗传信息的改变和丢失，如果DNA加合物在细胞复制前没有被修复或被错误地修复，则可导致基因突变，引起不可逆的基因损伤，进而诱发突变及肿瘤。可见，DNA加合物的形成与致癌作用之间存在着一定的因果关系，是反映化学致癌进程中一个早期的可探测的生物标志物。

GroupsnDNA adductPositive control group8155.26±33.98Low dose of pachymaran9134.93±21.77Middle dose of pachymaran1079.53±11.051)High dose of pachymaran1063.75±14.671)

Note：Compared with positive control group，1)P<0.01.

甲醛是确定的人类致癌物，广泛存在于环境污染物中，如住宅装修所用人造板材(大芯板、复合地板)、油漆及卷烟烟气会导致室内空气甲醛污染[5]。活泼的醛基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内的亲核基团，如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶，可与DNA分子发生共价结合形成醛类DNA加合物，属碱基修饰类DNA损伤[6]。本研究中用甲醛染毒，确保实验小鼠血清中有可供检测的DNA加合物。

研究结果表明，当剂量高于2.0 g/L时，茯苓多糖具有较好的抑制DNA加合物形成作用，且存在明显的剂量-效应关系，剂量越大，抑制效应越明显，说明茯苓多糖具有较好的抗遗传损伤作用。

可见，茯苓多糖作为天然免疫多糖，不仅能促进细胞免疫功能，还有明显的抗遗传损伤效应，值得开发应用。