钩状效应对化学发光法测定甲胎蛋白的影响与解决方案探讨

崔怀中 王 莹 孙少丹

(杭州市西溪医院杭州市第六人民医院检验科,杭州 310023)

化学发光免疫分析(Chemiluminescence immuno-assay，CLIA)是化学发光与免疫分析相结合的一种分析方法。由于它具有灵敏度高、特异性好、分析速度快、操作简便等优点，近年来在临床诊断等领域中得到了广泛运用[1]。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)是人类发现的第一个蛋白类肿瘤标志物，已广泛应用于肝癌的诊断和治疗监测[2]。钩状效应即Hook效应是指免疫分析中由于抗原抗体比例不合适而导致的假阴性或测定值小于真实值的现象。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与抗原抗体的比例有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均只有在两者比例合适时才出现最显著的抗原抗体反应，否则将可能导致测定结果低于实际结果[3]。本文报告了使用CLIA测定AFP过程中，由于钩状效应导致测定结果远远低于实际值的现象，并探讨针对该现象的解决方案。

1 资料与方法

1.1资料 2017年6月18日在我院住院治疗的患者，男，40岁，临床诊断为肝恶性肿瘤，核磁共振(MRI)检查结果为：“肝脏右叶巨块型肝癌伴肝内弥漫多发转移结节，门脉内广泛癌栓形成，附见：两肺弥漫多发转移瘤”。2017年6月18日至2017年12月31日本院实验室进行AFP测定的标本39 484份。

1.2实验方法 抽取受检者清晨空腹静脉血约5 ml 于含惰性分离胶的促凝管中，静置30 min，待标本充分凝固后，4 000 r/min离心10 min后上机检测。检测仪器为美国 Beckman-Coulter DxI800全自动化学发光分析仪，试剂为原装配套试剂，批号625284。所有项目检测前均室内质控在控，所有操作严格按照标准操作说明书进行。

2 结果

表1对AFP浓度为1154772ng/ml的标本进行梯度稀释后测定结果

Tab.1DeterminationofAFPconcentrationof1154772ng/mlaftergradientdilution

Dilution method(serum∶dilution)Relative light unitby instrumentInstrument displayresults(ng/ml)Theoreticalconcentration(ng/ml)1∶117 381 506>3 000577 3862∶117 012 470>3 000769 8483∶115 416 133>3 000866 0794∶115 337 849>3 000923 8185∶115 043 745>3 000962 3106∶114 052 4632 871989 8057∶113 654 4652 7551 010 4268∶113 245 5462 6071 026 464Undiluted12 355 4122 3031 154 772

Note：The method of determination is to dilute the specimen with the above ratio and then use the built-in dilution mode of the instrument.

2.1钩状效应影响AFP测定结果的发现过程及处理措施 该标本医生同时开了AFP测定和AFP稀释测定(仪器预置的稀释测定模式，稀释倍数为18倍)，仪器测定的结果分别为2 303 ng/ml和>54 000 ng/ml。由于两个结果间存在明显的逻辑错误，因此对该标本进一步进行手工的稀释测定，经500倍稀释后测得结果为1 154 772 ng/ml。对于诊断为肝恶性肿瘤的患者来说，AFP测定结果为2 303 ng/ml是完全可能的结果，可见如果该标本医生没有同时开AFP稀释测定，实验室将很有可能报告出一个错误的结果。为避免可能错误的发生，通过和仪器厂家工程师的沟通，我实验室决定将此后AFP>2 000 ng/ml 的标本全部在仪器上进行稀释模式复测。从2017年6月18日至2017年12月31日本院实验室共测定AFP标本39 484份，其中大于2 000 ng/ml标本200份，144份标本仪器直接给出了>3 000 ng/ml的结果。对其他56份仪器测定结果为2 000 ng/ml以上的标本,经稀释复测后发现由于钩状效应而导致的错误结果标本。期间对仪器测定结果为1 000～2 000 ng/ml的标本，由于此结果段内标本数量较多，采用随机抽取的方式抽取了100份标本进行稀释复测，未发现由于钩状效应而导致的错误结果。

2.2对高浓度标本进行梯度稀释后测定结果 对AFP浓度为1 154 772 ng/ml的标本进行梯度稀释，当血清量与稀释液量为6∶1时开始出现由于钩状效应而导致的错误结果，此时稀释后标本的理论浓度为989 805 ng/ml。

3 讨论

钩状效应可导致测定结果偏离实际值，如果实验室人员没有发现则可能发出错误的报告而影响到患者的诊断和治疗，因此钩状效应是免疫法测定中必须重视的问题。化学发光法作为免疫分析的一种，必然也会存在钩状效应[4]。DxI800全自动化学发光分析仪为避免钩状效应对测定结果的影响，当测定时如果仪器测定的相对光单位(Relative light unit,RLU)大于一定的值时，仪器会直接给出>3 000 ng/ml的结果，而不给出具体的数值。但是如果AFP浓度过高则可能由于严重的钩状效应使仪器给出一个错误的结果[5]。由于AFP在不同的肝癌患者中可能存在着巨大的差异，因此单从临床诊断上通常难以发现错误的存在。所以笔者所在实验室通过对所有测定值>2 000 ng/ml的标本进行稀释复测，在39 484份标本中发现3份标本由于显著的钩状效应而得出了错误的结果。虽然所占比例不足万分之一，但测定结果与真实结果相差巨大，如果发出这样的错误报告很可能对临床诊断和实验室声誉造成巨大影响，因此必须引起重视。在AFP试剂的说明书中提到“达到50 0000 ng/ml时，AFP测定不会表现出钩状效应”，可见当AFP浓度>500 000 ng/ml时就可能存在钩状效应，但说明书中并未对AFP浓度极高时仪器可能给出完全错误的结果进行明确的说明。根据本研究对极高浓度标本进行梯度稀释测定的结果，可见当AFP浓度>98 9805 ng/ml时就会由于钩状效应，仪器给出完全错误的结果。因此笔者所在实验室采取了对所有测定值>2 000 ng/ml的标本进行稀释复测，但目前所采用的>2 000 ng/ml必须稀释复测的规则只是基于本实验所发现的由于钩状效应导致错误结果时仪器给出的结果均在2 000 ng/ml以上而定的，并无明确的理论依据。对于仪器测定值在2 000 ng/ml以下的标本，本实验室进行部分标本的抽样稀释复测中，未发现钩状效应的存在，但不能排除仪器测定结果为2 000 ng/ml 以下时存在钩状效应的可能。因此还需要仪器生产商进一步改进仪器和试剂性能来避免此类错误的发生。

AFP是目前应用最广泛的诊断原发性肝癌的肿瘤标志物，是临床公认的肝细胞肝癌诊断最敏感标志物之一，其不仅在筛查和诊断中起重要作用，同时对原发性肝癌患者的预后判断和治疗监测也起重要的作用[6,7]。其检测结果一直受到临床医生和患者的高度重视，其检测结果的稳定性和准确性与患者的治疗方案紧密相关，低于真实值的结果会给临床医生或患者错误的提示，延误治疗或影响疗效判断。因此，作为检验工作者必须要加强责任心，充分认识到仪器可能存在的局限性以及钩状效应可能对结果产生的严重影响。对可疑的结果要及时跟临床医生进行沟通并结合患者的病情及其他检查结果综合分析、讨论，必要时对标本进行复测或稀释后复测避免因钩状效应或其他原因导致检验结果的错报。