土壤富硒细菌的筛选、鉴定①

廖 青，刘永贤，邢 颖，梁潘霞，潘丽萍，陈锦平，江泽普



土壤富硒细菌的筛选、鉴定①

廖 青，刘永贤，邢 颖，梁潘霞，潘丽萍，陈锦平，江泽普*

(广西农业科学院农业资源与环境研究所/广西富硒农业研究中心，南宁 530007)

从广西不同富硒区土壤中分离出32株耐硒细菌，通过优化加硒时间、培养时间及加硒浓度进行富硒试验，筛选获得4株富硒能力较强的细菌，进一步通过对4株细菌16S rDNA序列分析及系统发育树分析明确了各菌株的种属关系。经鉴定，YLB1-6为，TXB1-10为，TXB2-5为，GPB1-5为。在最适加硒时间、培养时间及适宜加硒浓度条件下，各菌株的硒转化率分别为：YLB1-6 74.22%，TXB1-10 66.05%，TXB2-5 55.31%，GPB1-5 63.30%。各菌株处理能显著提高土壤可交换态硒含量，对土壤硒起到较强活化作用。土壤富硒细菌为硒转化提供更多的高效微生物载体，并为富硒产品开发研究提供技术支持。

富硒细菌；硒转化率；筛选；鉴定

硒是人体必需的一种微量营养元素，对人体有预防疾病、增强体质及延缓衰老等功效[1]。广西富硒土壤面积达212万hm2[2]，土壤硒含量最高可达2.29 mg/kg[3]，为发展富硒农产品提供了有利的基础条件。然而，广西富硒土壤多呈酸性，土壤中的硒易与铁形成难溶的复合亚硒酸铁，从而导致其有效性较低[4]，直接影响了广西富硒土壤资源的有效利用。研究表明，土壤硒的生物有效性受到环境微生物的显著影响[5]，微生物通过自身代谢作用可以实现硒形态、价态的转化，从而提高土壤硒的生物有效利用率。因此，筛选高效、稳定的具有硒代谢转化能力的富硒微生物，是开发利用土壤硒资源的有效途径。

对土壤微生物硒耐受性进行研究，发现硒的耐受性：细菌>真菌>放线菌[6]，土壤细菌能在高硒环境下将无机硒转化且生长良好，说明土壤细菌对硒具有较好的代谢能力。因此，本研究主要侧重于富硒土壤中细菌的分离，采用含硒培养基筛选耐硒细菌，进一步通过富硒试验获得硒转化能力强的菌株，并对其进行鉴定，以期获得硒高效转化微生物载体，为土壤硒资源利用、富硒农产品生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂

液体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.3±0.2；固体培养基：营养琼脂，购自广东环凯微生物科技有限公司。所有培养基均在121 ℃灭菌20 min后使用。

亚硒酸钠(Na2SeO3，AR 98%)购自山东西亚化学工业有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他化学药品均为国内生产的分析纯产品。

硒液制备：称取22.35 g Na2SeO3，溶于去离子水中并定容至100 ml，此溶液硒浓度为100 mg/ml，使用无菌滤头(0.22 μm)过滤后备用，存于避光处。使用时取上述硒液用灭菌去离子水稀释至20 mg/ml。

1.2 菌株的分离和纯化

从广西多个富硒区采集土壤样品，称取10 g土样加入到预先装有10颗玻璃珠的90 ml的无菌PBS中，30 ℃、200 r/min振荡30 min，静置5 min，收集土壤悬液，于5 000 r/min离心15 min，沉淀用10 ml PBS悬浮，4 ℃ 保存备用。取2 ml制备好的样品加入到100 ml含硒浓度为100 μg/ml的液体培养基中，30 ℃、200 r/min震荡培养2 d进行筛选，然后用梯度稀释法制备10-2~ 10-6系列稀释液，取100 μl分别涂布到固体培养基中，30 ℃下培养至菌落长好，挑取具有不同菌落形态特征的单个菌落，采用平板划线法进行重复分离纯化，获得菌株纯培养物。

1.3 菌株生长曲线测定

从固体培养基上挑取菌株接种于含10 ml 液体培养基的培养瓶中，活化后按5% 接种量转接于100 ml液体培养基的三角瓶中，37 ℃ 摇床培养，每隔1 h取样液，用分光光度计在530 nm波长下测定吸光度值，绘制菌株的生长曲线。

1.4 适宜硒浓度的测定

按1 μg/ml硒浓度梯度递增依次制备含硒量为1 ~ 20 μg/ml的液体培养基，待菌株活化后，按5%接种量依次接种于上述含硒液体培养基中，37 ℃摇床培养，根据菌液颜色变化确定适宜硒质量浓度。

1.5 富硒能力测定

菌株活化后按5% 接种量转接于100 ml液体培养基的三角瓶中，在菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行摇床培养。将培养好的菌悬液4 000 r/min离心30 min，取上清液经消解反应后用原子荧光光度计测量荧光强度值，由标准曲线可得样液的硒浓度，由硒转化率公式获悉菌株的富硒能力[7]。

硒转化率(%)=(总硒含量-残留无机硒含量)/总硒含量×100

1.6 菌株的鉴定

挑选具有较强富硒能力的菌株，用液体培养基活化，提取细菌基因组总DNA并以其为模板，采用细菌通用引物(27F/1492R)扩增其16S rRNA基因片段，PCR扩增产物用胶回收试剂盒进行回收纯化后在ABI3730测序仪上进行测序。将所得序列与GenBank数据库中序列进行比对，用MEGA5.0软件构建系统进化树，明确菌株的种属关系。

1.7 菌株对土壤硒的活化

利用浸提剂提取的土壤化学有效性可反映土壤硒的生物有效性[8]。菌株土壤硒活化试验方法参照龙云川等[9]的方法进行。富硒土壤中的水溶态硒用超纯水浸提，可交换态硒用0.1 mol/L KH2PO4- K2HPO4溶液浸提[10]。样品经相关处理后，其硒含量用原子荧光光谱仪测定。

1.8 数据处理

采用DPS 7.05软件进行统计分析，并采用 Microsoft Office Excel 2003软件进行图表制作。

2 结果与讨论

2.1 耐硒细菌的筛选

本试验从广西永福(砂页岩红壤，全硒0.567 mg/kg)、玉林(砂页岩赤红壤，全硒1.804 mg/kg)、桂平(砂页岩赤红壤，全硒1.188 mg/kg)、藤县(砂页岩赤红壤，全硒0.580 mg/kg)等多个富硒区采集土壤样品，采用含硒液体培养基进行耐硒细菌筛选，并利用梯度稀释涂板法分离获得具有不同菌落特征的细菌32株。采用平板划线法将这些菌株进行纯化，菌株纯化后于试管斜面上4 ℃保藏。所获耐硒细菌中，6株来源于永福，9株来源于玉林，12株来源于藤县，5株来源于桂平，表明广西不同富硒区中，砂页岩母质红壤、赤红壤均有耐硒细菌存在。

2.2 菌株的生长曲线

由菌株生长曲线可知菌株的对数生长期及所需培养时间。对各耐硒菌株进行生长曲线测定后发现，不同耐硒细菌进入对数生长期的时间及其持续时间、到达生长稳定期所需时间均存在差异。从生长周期考虑，本研究筛选出4株培养时间较短的菌株进行下一步研究。4株耐硒细菌分别命名为YLB1-6(玉林)、TXB1-10(藤县)、TXB2-5(藤县)和GPB1-5(桂平)，其生长曲线如图1所示，YLB1-6在1 ~ 4 h时处于对数生长期，对数期出现较早且较短，4 ~ 7 h处在稳定期；其他3株细菌在2 ~ 6 h处于对数生长期，6 ~ 10 h处于稳定期。菌株对数生长期细胞生长速率最快，代谢也最为旺盛，这个时期加硒有利于硒的转化，但加硒过早会对菌体代谢活动有抑制作用[11]，过晚菌体发生自溶也会导致转化率低，因此在对数生长期的中期加硒转化效果最好。由此确定，YLB1-6最适加硒时间为第2.5 h，培养时间为7 h；其他3株细菌最适加硒时间为第4 h，培养时间为10 h。

图1 耐硒细菌生长曲线

2.3 菌株适宜硒浓度的确定

不同硒浓度下，各菌株菌液颜色变化如表1所示。随着液体培养基中硒浓度的增加，菌液呈不红→红色不明显→红色变化趋势。当菌液出现红色时，说明菌株将Na2SeO3转化为红色单质硒[12]，为了避免过多单质硒的产生，提高有机硒的转化率，选择菌液呈红色不明显时的硒浓度作为适宜硒浓度，即YLB1-6和TXB2-5为6 μg/ml，TXB1-10为4 μg/ml，GPB1-5为8 μg/ml。

表1 不同硒浓度菌液颜色变化

注：“-”表示菌液没变红，“○”表示菌液红色不明显，“+”表示菌液呈红色。

2.4 菌株的富硒能力

在各菌株适宜硒浓度、适宜加硒时间及其合适培养时间条件下进行菌株富硒试验，由硒转化率公式可知各菌株的富硒能力。经富硒试验后，YLB1-6、TXB1-10、TXB2-5和GPB1-5残留无机硒含量分别为1.547、1.358、2.681和2.936 μg/ml，菌株硒转化率依次为74.22%、66.05%、55.31% 和63.30%，YLB1-6与TXB1-10、GPB1-5和TXB2-5菌株之间的硒转化率差异均达极显著水平，4个耐硒菌富硒能力由大到小排序为：YLB1-6＞TXB1-10＞GPB1-5＞TXB2-5(表2)。目前国内外文献报道的富硒细菌，其硒转化率为50% ~ 80%[7,11-14]。本研究所筛4株富硒细菌的硒转化率均达50% 以上，具有较强富硒能力。

表2 富硒细菌的硒转化率

注：同列数据后大小写字母不同分别表示差异达到<0.01 和<0.05显著水平，下表同。

2.5 富硒细菌的鉴定

通过PCR扩增，各富硒细菌的16S rDNA序列长度均在1 450 bp左右。BLAST分析结果(表3)表明，这4 株富硒细菌与其同源菌株相似性均在 99% 以上；进一步采用Neighbor-Joining方法构建了富硒细菌的系统发育树(图2)，经鉴定，YLB1-6为，TXB1-10为，TXB2-5为，GPB1-5为。目前文献报道的富硒细菌有、、和[13,15]，而本研究中和具有富硒能力为首次报道，丰富了富硒菌株的种类。

表3 菌株 16S rDNA 序列同源性分析结果

图2 基于16S rDNA序列的系统发育树

2.6 菌株对土壤硒的活化能力

水溶态硒和可交换态硒是土壤有效硒的主要形态。从表4可以看出，各处理中可交换态硒为主要的有效硒形态，而水溶性硒所占有效硒的比例较小；土壤经各菌株制成的菌剂处理后，各处理水溶态硒与CK相比无明显差异，而可交换态硒均有不同程度的提高。CK可交换态硒含量为0.053 mg/kg，各菌剂处理的可交换态硒含量提高至0.085 ~ 0.112 mg/kg，其中YLB1-6和TXB1-10菌剂处理均极显著提高了土壤可交换态硒含量(＜0.01)，TXB2-5和GPB1-5菌剂处理也显著提高了土壤可交换态硒含量(＜0.05)。本研究中，土壤经菌剂处理后，可交换态硒含量显著提高，可能是吸附于氧化物和黏土矿物表面的亚硒酸盐更易与菌株分泌的肽、氨基酸结合从而获得释放，也可能是菌株分泌胞外磷酸酶溶解土壤中的难溶性磷，磷元素释放的同时与之伴生的硒元素也被活化释放，其活化机制有待进一步研究。相关研究表明，通过土壤微生物代谢转化获得的硒是一种重要的生物有效硒[16-17]，它在提高土壤硒生物有效性方面具有巨大的潜力。因此，土壤富硒细菌作为作物硒生物强化的潜在工具，在富硒作物生产上具有实际应用价值。

表4 土壤处理后水溶态硒和可交换态硒含量

3 结论

从广西多个富硒区分离筛选到4 株富硒能力较强的菌株：YLB1-6(玉林)、TXB1-10(藤县)、TXB2-5 (藤县)和GPB1-5(桂平)，经16S rDNA 序列分析及系统发育树分析，YLB1-6 为，TXB1- 10 为，TXB2-5为，GPB1-5 为，这些富硒细菌对硒的转化率为55.31% ~ 74.22%，各菌株处理能显著提高土壤可交换态硒含量，对土壤硒起到较强活化作用。在土壤微生物硒强化中具有潜在的应用价值。

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Screening and Identification of Se-enriched Bacteria from Se-rich Soils in Guangxi

LIAO Qing, LIU Yongxian, XING Ying, LIANG Panxia, PAN Liping, CHEN Jinping, JIANG Zepu*

(Agricultural Resource and Environmental Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Selenium Enriched Agriculture Research Center of Guangxi, Nanning 530007, China)

32 Se-tolerance strains were isolated from Se-rich soils in Guangxi. Se-enriched test were conducted by optimizing the time of adding Na2SeO3, the incubation time and Na2SeO3concentration, and 4 bacterial strains with strong Se-enriched ability were screened out. Furthermore, the species of these 4 bacterial strains were determined based on the sequencing of 16S rDNA and phylogenetic analysis as(YLB1-6),(TXB1-10),(TXB2-5) and(GPB1-5), respectively. Under the condition of the optimum time of adding Na2SeO3, the suitable incubation time and optimal Na2SeO3concentration, the ratio of Se transformation of each strain was as follow: YLB1-6 74.22%, TXB1-10 66.05%, TXB2-5 55.31%, GPB1-5 63.30%. Furthermore, all strains treatments could significantly increase the exchangeable Se contents and have strong activating effect on soil Se. Soil Se-enriched bacteria provides more efficient microorganism carrier for Se transformation and provide technical support for Se-enriched products development.

Se-enriched bacteria; Ratio of Se transformation; Screening; Identification

国家自然科学基金项目(41761052)、广西创新驱动重大专项项目(桂科AA17202019-1、桂科AA17202019-4、桂科AA17202026)、广西重点研发计划项目(桂科AB16380207)、广西农业重点科技计划项目(201604)、广西青年基金项目(2016GXNSFBA380131)、广西富硒特色作物试验站项目(桂TS2016011)、广西农业科学院基本科研业务专项项目(2015YT33、桂农科2017YZ03)和广西农业科学院科技发展基金项目(桂农科2017JM01，桂农科2017JM03，桂农科2018JZ21)资助。

(lzjeep@163.com)

廖青(1981—)，女，广西梧州人，硕士，副研究员，主要从事土壤生态和高值农业研究。E-mail: liaoqing81@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.06.023

Q939.9

A