HPLC法测定谷子籽粒叶酸含量及种质资源评价①

侯思宇，宋 敏，闫陆飞，孙朝霞，韩渊怀，李红英



HPLC法测定谷子籽粒叶酸含量及种质资源评价①

侯思宇，宋 敏，闫陆飞，孙朝霞，韩渊怀*，李红英

(山西农业大学农学院，山西太谷 030801)

谷子籽粒中富含叶酸，作为一种功能性食品深受北方人民的喜爱，而作物籽粒，如小米叶酸测定方法及含量分析存在较大差异，为小米品质鉴定及高叶酸谷子种质筛选造成了一定困难。本研究通过“三酶法”提取小米中的叶酸，建立了一种基于高效液相色谱技术(HPLC)高效化、规模化且稳定适用于测定谷子籽粒叶酸含量的方法，对2016 年和2017年种植的45个谷子种质进行叶酸含量测定和分类评价。结果表明：叶酸标准品梯度曲线呈线性方程相关，相关系数为0.99；小米样品叶酸测定过程中精密度、稳定性和重复性的相对标准偏差(RSD)分别为0.81%、1.19% 和1.65%，各项指标符合精密测定标准，准确度高，重复性好；45个谷子种质籽粒叶酸含量分布范围为0.26 ~ 2.56 μg/g(2016年度)和0.53 ~ 2.86 μg/g(2017年度)，含量均值分别为1.19和1.84 μg/g，标准差0.47和0.51 μg/g，变异系数39.5% 和27.7%；对上述种质进行正态分布曲线分析，发现叶酸含量整体呈现偏度分布；从中筛选出9个高叶酸(含量≥1.91 μg/g)和3个低叶酸(含量≤1.15 μg/g)的谷子种质。上述结论为小米叶酸含量提供了测定标准和评价体系，也为高叶酸谷子种质创新与利用奠定了基础。

谷子；高效液相色谱法；叶酸；种质资源

叶酸(folic acid)，又称维生素B9，参与生物的一碳代谢[1]。在植物中，叶酸所介导的一碳代谢反应涉及生物体内核酸、氨基酸和泛酸盐等代谢功能，还促进植物木质素合成和光呼吸，具有广泛的生物学意义[2-3]。叶酸对人类营养和健康有着不容忽视的作用，尤其是预防新生儿先天疾病方面具有重要意义[4]。另外，最新的研究表明，叶酸在抑郁症[5]、阿兹海默症[6]、慢性胃酸性胃炎[7]等疾病的治疗和预防方面都有一定的功效。植物、真菌和大多数细菌都具备从头合成叶酸的能力，但是高等动物包括人类却无法自身合成叶酸，其来源完全依赖日常饮食摄入，从而完成体内生理生化代谢过程[8]。为了弥补叶酸缺乏，我国自1998年起开始了叶酸强化政策，规定在小麦面粉中添加量为1 ~ 3 mg/kg[9]。尽管当前市场能够提供多种富含叶酸食品，且多个国家(包括中国)也制定了免费发放叶酸片剂以满足叶酸缺乏人群的相关政策，但对于多数发展中国家，尤其是偏远地区，由于饮食习惯等原因导致部分人群仍然严重缺乏叶酸。

谷子((L.) P. Beauvois)是重要的杂粮作物，也是“老少边穷”地区重要作物，其籽粒脱壳后称之为“小米”，富含多种营养物质。在山西、陕西、河北、内蒙、东北等地，一直有种植谷子的传统，尤其深受孕妇和老人喜爱。随着“健康中国”理念的深入人心，人们日常摄入食物的多样性日益增加，谷子作为叶酸强化食品原料也越来越被普通大众认可[10]。尤其是种植于山西地区的小米本身具有高叶酸含量这一独特品质，越来越受到人们的喜爱。目前，在植物叶酸提取工艺优化[11]、营养价值评价[12]及作物转基因叶酸育种[13-17]等研究方面已取得一些成果。尽管已报道了一些植物叶酸提取方法，如单酶法[18]、水浴浸提法[19]、超声提取法[20]和三酶法[21]等，但有关谷子籽粒叶酸测定的报道较少。本试验优化了一种适用于谷子籽粒叶酸提取的三酶法，同时建立了高效液相色谱(high performance liquid chromato­graphy, HPLC)测定叶酸的方法，并基于这种稳定可靠和规模化提取–测定叶酸的最优方法，对45份谷子种质进行了叶酸分类评价，为评价优异谷子种质，尤其是评价高叶酸谷子种质提供了方案及标准。

1 材料和方法

1.1 试验材料及种植情况

收集了45个谷子种质资源，于2016年和2017年种植于山西农业大学农学院试验站2个不同地块中(37°42¢N，112°58¢E)，成熟期收获谷子单穗，并脱粒作为试验材料。供试土壤为黄壤土，参考董建江等[22]和刘钊等[23]方法，测定了2个试验地原始土壤肥力特性(表1)。

1.2 谷子籽粒叶酸提取方法

参考孟繁磊等[24]采用三酶法提取大豆籽粒叶酸方法，针对小米叶酸提取略有改动。如：将小米研成粉末过100目筛子；叶酸提取液依次加入8 μl α–淀粉酶、70 μl蛋白酶和2%大鼠血清(活性炭过滤)。

表1 试验土壤主要肥力特性

1.3 HPLC法测定叶酸标准品及样品

精确称取0.01 g叶酸标准品，用0.1 mol/L KH2PO4(pH 7.0，1% 抗坏血酸，0.1% β-巯基乙醇)溶解定容至10 ml，得到浓度为1 μg/μl的叶酸标准品母液，从中吸取1 μl定容至1 ml，即叶酸标准液浓度为1 ng/μl；分别吸取叶酸标准液1、2、4、6、8、10、16、20、30、50 μl定容至1 ml，分别即为1、2、4、6、8、10、16、20、30、50 ng/μl；经0.45 μm滤膜过滤后放于棕色进样瓶中，4 ℃避光放置备用，得到浓度为1 ~ 50 ng/μl叶酸标准品溶液，设置3次重复并记录峰面积平均值。横坐标为进样叶酸含量，纵坐标峰为面积绘制标准曲线。

叶酸测定色谱条件：配置的流动相为0.01 mol/L KH2PO4:CH3OH(89:11，pH 6.3)；液相色谱仪设定柱温25 ℃；流速为1.0 ml/min；进样量为20 μl；紫外检验波长280 nm；使用C18色谱柱(4.6 nm×150 nm×5 μm)进行分析。

以‘晋谷21’为检测样品，针对叶酸的精密度、稳定性和重复性进行分析。

1.4 数据统计分析

所有测定样品的数据采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0软件进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 叶酸标准曲线建立及色谱图分析

以叶酸标准品含量为横坐标，所对应峰面积为纵坐标绘制叶酸标准曲线，并计算得到线性回归方程为=0.721 2+0.561 1，其绝对系数2= 0.998 8。结果表明，谷子叶酸标准品的含量与峰面积呈线性对应关系，叶酸在1 ~ 50 ng/μl范围内线性关系良好。对比叶酸标准品及谷子籽粒提取样品色谱图(图 1A和1B)，结果表明，叶酸标准品峰型保留时间在3.24 min，其峰型单一，峰尖锐利，结果表明标准品纯度较高，无杂质残留。相比标准品测定色谱图，小米样品，保留时间1 ~ 3 min存在杂峰，在3.24 min可检测到峰型，其峰型与叶酸标准品一致，且峰形锐利。以上结果表明，采用高效液相色谱的方法可以准确检测到谷子叶酸组分，并进行相对定量，并为后续测定谷子叶酸含量试验奠定基础。

2.2 叶酸样品精密度、稳定性及重复性检测

对30 ng/μl的叶酸溶液和晋谷21浸提液分别平行进样5次，记录峰面积，测得标品和样品的叶酸峰面积平均值分别为22.34 mAU和18.75 mAU，相对标准偏差RSD值分别为0.79% 和0.81%，均<1 %(表2)，表明本试验仪器精密度较好，可用于进行相关测定试验。

在测定的12 h内，样品浸提液每隔2 h进样一次并记录峰面积，测得RSD为1.19%，<2%(表3)，符合中华人民共和国药典中重现性RSD<2% 的要求；5次样品浸提液峰面积的平均值为18.71 mAU，RSD为1.65%(表4)，说明样品提取的重复性较好，数据重现性较好，稳定性高。

2.3 谷子叶酸含量差异分析与种质评价

如表5和图2所示，2016年种植于试验田I的小米叶酸含量整体呈正态分布，变化幅度为0.26 ~ 2.56 μg/g，中位值为1.25 μg/g，平均含量为1.19 μg/g，变异系数为39.5%；该年不同谷子种质叶酸含量正态分布曲线显示，其偏度系数为0.2(>0)，叶酸含量测定值重尾在右侧为右偏态，峰度系数为0.28，说明多数品种的叶酸含量大于平均值。同样的，2017年小米叶酸含量也呈正态分布，变化幅度为0.53 ~ 2.86 μg/g，中位值为1.92 μg/g，平均含量为1.84 μg/g，变异系数为27.7%，较上一年高。而2017年谷子叶酸偏度系数和峰度系数分别为-0.26和-0.36(均<0)，说明叶酸含量正态分布曲线重尾在左侧为左偏态，且多数品种的叶酸含量小于平均值1.84 μg/g。通过比较2016年和2017年种植的小米叶酸含量的各项统计值，发现这两年的叶酸含量差异较大。

(A. 叶酸标准品；B. 谷子籽粒提取样品)

表2 精密度试验结果

表3 稳定性试验结果

表4 重复性试验结果

表5 谷子叶酸含量统计(μg/g)

图2 2016年和2017年45份谷子品种叶酸含量整体分布

以平均值和标准差为判断依据，将含量≥1.91 μg/g的定为高叶酸品种，≤1.15 μg/g的定为低叶酸品种，其中高叶酸谷子种质有：B360、SX32、豫谷1号、晋汾52、晋谷29、B387、晋谷35、长生08和晋谷21等；低叶酸谷子种质主要有：平定大谷、SX39和B185(表6)。

表6 部分高、低叶酸含量谷子种质(μg/g)

3 讨论

本试验首次采用三酶法对小米的叶酸进行提取，与前人曾采用的水浴浸提法相比[25]，二者都选用磷酸缓冲溶液作提取液，不同点是水浴浸提法采用化学方法，用活性炭吸附叶酸后再依次洗脱；而本文采取较温和的生物酶解法，先用α-淀粉酶去糊化，再用蛋白酶去蛋白，最后采用大鼠血清将多聚谷氨酸叶酸水解成单谷氨酸叶酸。由于叶酸提取过程中很容易被氧化降解，而三酶法反应温和，相比其他化学方法可以较好保护叶酸，防止其被氧化，并且被很多学者应用于其他作物的叶酸提取。孟繁磊等[24]和董薇[26]研究采用各自优化的体系分别对大豆种子和大米籽粒进行总叶酸提取，可见三酶法是目前作物叶酸提取的首选方法。另外，目前测定叶酸的主要方法有高效液相色谱法、微生物检测法以及间接荧光法。邵丽华和王莉[25]采用间接荧光法测定小米叶酸虽然能测定出叶酸总含量，但相对标准偏差为1.68%，本试验为0.30%，因此高效液相色谱法测定叶酸精确度更高。此外前人报道微生物检测法的重复性较差，而本研究中采用高效液相色谱法测定叶酸的重复性和精密度都较好。

酵母、肝脏等动物类食品中富含较多叶酸，而绿叶蔬菜和豆类等植物类食品也富含叶酸，相比之下，谷类作物其叶酸含量较低。本研究对45份谷子种质资源籽粒进行总叶酸含量测定，综合两年测定数据，分析表明小米叶酸含量变幅为0.23 ~ 2.86 μg/g，平均叶酸含量为1.52 μg/g。相关研究表明，不同品种糙米和精米的叶酸含量，其变化幅度分别为0.133 ~ 1.114 μg/g和0.103 ~ 0.777 μg/g[26]。大豆籽粒叶酸含量为1.436 ~ 3.096 μg/g[24]。主要粮食的叶酸含量在0.39 ~ 2.63 μg/g范围内，其中大豆＞花生＞绿豆＞小米＞燕麦＞玉米＞苦荞＞黍米＞面粉＞薏米＞大米[25]。同时研究发现豆类远远大于谷物或玉米，最少的是糙米和大米[26]。由此可见，在主要的作物中，小米叶酸含量仅次于大豆，为满足成年人日均叶酸最佳摄入量400 μg以及孕妇600 μg的需求量，建议要均衡饮食，平时要多摄入豆类以及蔬菜等富含叶酸的食物，尤其是青少年、老人以及孕妇等容易缺乏叶酸的人群。

此外，谷子不宜重茬，因此本试验选用不同地块种植，45份谷子资源叶酸含量测定，发现两年间谷子籽粒叶酸含量差异较大。其原因可能为谷子籽粒叶酸含量与土壤条件有一定关系，同一品种的谷子因为种植土壤的条件不同，叶酸含量也存在较大差异，如晋谷21在2017年的叶酸含量为2.00 ± 0.02 μg/g，而2016年的叶酸含量却为1.46 ± 0.15 μg/g，两者叶酸含量存在明显差异。前人研究发现不同生态条件下，小米叶酸含量有明显差异，这表明小米的叶酸含量不仅与品种差异有关，还可能与土壤条件、气候、生态环境等因素有关，同时研究发现小米叶酸含量与米色差异有关[27]，因此我们下一步计划探究米色色泽与叶酸以及类胡萝卜素之间的分子机理，为以后打造山西功能性小米的发展做铺垫。

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Evaluation and Detection of Folic Acid Content of Seeds Among Foxtail Millet Accessions by HPLC Method

HOU Siyu, SONG Min, YAN Lufei, SUN Zhaoxia, HAN Yuanhuai*, LI Hongying

(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu, Shanxi 030801, China)

Foxtail millet is a kind of functional food rich in folic acid, and it is popular in the northern China. However, there are significant differences in folic acid contents in crop grains, such as the determination method and content analysis of folate in Foxtail millet, which make it difficult to identify the quality of millet and select the germplasm with high folate content. In this study, ‘triple-enzymes method’ was used to isolate folic acid from foxtail millet grains and construct a large-scale detection method by HPLC for folic acid content. Meantime, the folic acid contents were assessed among 45 accessions of foxtail millet in 2016 and 2017. The results showed that: based on HPLC, a folic acid content determination method for foxtail millet was successfully established. Folic acid standard curve showed the linear correlation between folic acid standard and peak area value, the correlation coefficient was 0.99. The relative standard deviation (RSD) was used to evaluate the precision, stability and repeatability in the detection process of folic acid content, and they were 0.81%, 1.19% and 1.65%, respectively. The range of grain folic acid content of 45 millet varieties were 0.26 ~ 2.56 μg/g in 2016 and 0.53 ~ 2.86 μg/g in 2017, with average values of 1.19 and 1.84 μg/g, standard deviation of 0.47 and 0.51 μg/g, and variation coefficient of 39.5% and 27.7%, respectively. The gaussian distribution had a little skewness. Finally, 9 high folic acid (folate content≥1.91 μg/g) and 3 low folic acid (folate content≤1.15 μg/g) accessions were screened from 45 millet accessions, respectively. This study not only provided the standard determination and evaluation system of folate in foxtail millet, and also laied a foundation for the innovation and utilization of high folate germplasm of foxtail millet.

Foxtail millet; HPLC; Folic acid; Germplasm resource

山西省农谷建设科研专项项目(SXNGJSKYZX201702)资助。

(swgctd@163.com)

侯思宇(1980—)，男，山西陵川人，博士，副教授，主要从事谷子营养品质研究。E-mail: 18635068055@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.06.028

S515；S326

A