组织工程心肌补片研究进展

谭瑶 综述 付炜 审校

【提要】 心肌梗死导致的心衰是威胁人类健康的主要心血管疾病，利用干细胞结合支架材料制备的组织工程心肌补片有望成为将来治疗心肌梗死的新希望。目前，关于组织工程心肌补片的研究众多，细胞和支架材料亦多种多样。本文对可能应用于组织工程心肌补片的种子细胞来源、支架材料以及影响组织工程心肌补片存活和功能的各种因素进行综述。

心血管疾病是威胁人类生命健康的主要疾病之一[1]。其中，心肌梗死是心血管疾病中较为常见且危害性极大的一类，主要是缺血缺氧导致心肌细胞坏死所致。由于心肌细胞属于永久性细胞，不具有再生能力，当缺血缺氧导致心肌细胞坏死后，只能由成纤维细胞代替，最后形成瘢痕组织，而受损心肌组织也会失去正常功能，最终导致心功能衰竭。为了改善终末期患者的心功能，心脏移植是目前最理想的办法。但是，供体心脏来源紧张，而其他治疗方法无法从根本上解决问题，并且治疗过程中可能出现大量并发症。

组织工程是利用种子细胞、支架等构建组织工程化器官和组织，达到对受损部位修复或替代的一种技术。组织工程心肌补片是通过模拟细胞外基质为心肌提供机械支持并将心肌细胞递送到梗死部位，进而实现限制心室重构、防止扩张、减少梗死面积、提高心室机械性能、减少凋亡等功能的组织工程产物。相比传统的治疗方法，组织工程心肌补片治疗心梗真正做到了“修补”心脏，不仅从疾病发生发展的源头治疗心梗，而且解决了移植心脏供体短缺的问题。本文将对组织工程心肌补片的种子细胞来源、支架材料及影响补片功能的关键因素进行综述。

1 组织工程心肌补片的种子细胞

研究表明，种子细胞能够弥补梗死后心肌细胞的丢失，并且种子细胞分泌的细胞因子等能够改善心肌梗死后的局部微环境，促进梗死区域的修复。种子细胞要求是具有活性的心肌细胞或能够增殖分化成心肌细胞的干细胞。部分哺乳动物在出生后的较短的一段时间内心肌细胞具有再生能力[2]。但是，人类在出生前心肌细胞就已经分化成熟，丧失了再生能力。因此，心肌补片的细胞来源是干细胞。干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定的条件下能够诱导分化成各种功能细胞。组织工程心肌补片的种子细胞主要来源包括胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞。

1.1 胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）

ESCs 是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性[3]，其分化潜能是任何干细胞都无法比拟的。研究发现，Wnt/β-连环蛋白信号通路对ESCs 向中胚层分化具有重要作用，Chibby 作为Wnt/β-连环蛋白的拮抗剂能够促进ESCs 向心肌细胞分化[4]。为了更好地将ESCs 运用到心梗患者的治疗上，相关研究将大动物作为研究对象，将ESCs 来源的心肌细胞移植到猕猴心脏体内，发现梗死面积明显减少，且有新生血管生成，但同时出现了心律失常的不良反应，导致该不良反应的具体原因仍有待研究[5]。最近，有研究将纤维蛋白包被的ESCs 移植到68 岁的严重心衰患者的心脏中，3个月后左室射血分数提高了10%，NYHA 功能分级由Ⅲ级变为Ⅰ级，且无心律失常、肿瘤形成等不良反应，成为ESCs 临床治疗严重心衰患者的首例[6]。随后又有6 位患者接受了类似的临床试验，患者的心功能均显著提高，且无不良反应[7]。这是组织工程心肌补片应用于心衰治疗的重要里程碑。但是，由于伦理因素及取材困难，胚胎干细胞的临床应用受到了极大的限制。

1.2 间充质干细胞（Mesenchyma stem cells，MSCs）

MSCs 是一类具有干细胞特性的细胞，来源广泛、增殖能力强、分化潜力大、免疫原性低、取材方便、易于工业化制备、无伦理学限制，具有强大的应用潜能[8]。MSCs 经诱导可分化为心肌细胞，可作为组织工程心肌补片的种子细胞。MSCs 的同种异体移植不会引起严重的免疫反应。但MSCs 在体内分化效率低，这是MSCs 应用于心梗治疗亟待解决的问题。研究认为，MSCs 对梗死部位修复起关键作用的是其释放的旁分泌因子。Blondiauxe 等[9]将MSCs 补片贴附在小鼠心外膜上，发现MSCs 补片通过旁分泌因子提高了梗死后心脏左心室射血分数，减轻梗死部位及周围组织的纤维化，并促进新生血管的形成。Zhang 等[10]发现，MSCs 可以通过小分子G 蛋白rap1 介导的信号通路调控心梗后缺血缺氧微环境下的细胞凋亡和炎症反应，进而改善梗死心脏功能。另外，MSCs 在改善心肌功能的同时是否会引起严重的心律失常还未完全明确。目前，MSCs 治疗心血管疾病进行了大量的临床研究，初步证实了MSCs 临床应用的安全性[11]。

1.3 诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）

iPSCs 是指将外源性基因导入体细胞内重编程而获得多能分化潜能的一类干细胞[12]。由于iPSCs 可通过诱导自体体细胞获得，避免了伦理问题和免疫排斥反应，临床应用上具有显著优势，是目前心肌再生领域的研究热点。但自体体细胞诱导成iPSCs 耗时长，无法用于急性心肌梗死的治疗。与ESCs 相似，iPSCs 亦可经诱导分化为心肌细胞。在大动物体内同种异体移植iPSCs 来源的心肌细胞对心脏功能具有明显的改善作用，但同样出现了短暂的心律失常现象[13]。同时，由于这些干细胞具有向三个胚层全面分化的能力，可能会形成胚胎瘤和子代嵌合体，因此需要成熟的培养分化技术诱导其向心肌细胞定向分化。

心肌的结构非常复杂，除心肌细胞外，还包括许多非心肌细胞，如内皮细胞、成纤维细胞等，这些细胞各自发挥作用。内皮细胞与血管生成密切相关，会影响移植心肌细胞的存活。研究发现，将内皮细胞和心肌细胞共培养，可增加新生血管形成，从而提高心肌细胞存活率。Sekine 等[14]通过将大鼠心肌细胞和内皮细胞共培养形成心肌补片，移植到发生心肌梗死的猪的心脏上，发现血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维生长因子等细胞因子分泌显著增加，新生血管增多，改善了心脏功能且未发生心律失常。成纤维细胞是维持心肌稳态的重要细胞，不仅能够促进内皮细胞增殖和血管形成产生基底膜，还能释放生物活性因子促进梗死后微血管生成[15]。这两种细胞对于心肌细胞存活意义重大，适当的细胞组成更加有利于梗死后心肌修复。

2 组织工程心肌补片的支架材料

理想的支架需要满足的条件：能够提供良好的机械支持、生物相容性、可降解性、整合性优良，能够为种子细胞的成熟和分化提供一个良好的微环境，并且没有无细胞毒性。组织工程支架材料主要包括天然材料和合成材料两大类。

2.1 天然材料

天然的支架材料包括细胞外基质、纤维蛋白、胶原纤维、藻朊酸盐等。因其来自天然组织，故更接近于正常细胞生长的环境。虽然天然组织工程支架优势明显，但获得符合要求的支架的技术目前还不够成熟。

2.1.1 细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）

ECM 常采用脱细胞的方法除去天然组织器官中的细胞而获得，具有与正常组织相同的结构，高度有序且具有条纹样的纳米结构。同时，细胞外基质保留了天然组织分泌生物因子的能力，能够为心肌细胞的存活提供良好的微环境[16]。Kameli 等[17]利用脱细胞心包联合MSCs 制成补片，移植到大鼠心梗部位，4 周后观察到心肌细胞再生以及新生血管的形成，且无炎症反应。表明天然的脱细胞支架能够促进梗死心肌修复，并最大程度地降低细胞免疫反应。研究发现，来源于成年人的ECM 中具有更多的胶原纤维沉积，可能更有利于电耦连，且具有更强的刚度；而来源于胎儿的ECM 孔隙更多，弹性更好，更有利于心肌细胞贴附，并可释放更多的旁分泌因子，有利于梗死后心肌的修复[18]。虽然ECM 优点明显，但目前脱细胞技术不够成熟，在脱细胞的过程中，原本的3D 结构可能遭到破坏，机械性能变差，在移植的过程中一些成分会被巨噬细胞介导的免疫反应快速降解。同时，残留的细胞碎片会引起免疫反应和影响内源性血管再生[19]。因此，利用ECM作为组织工程心肌补片支架的关键在于提高脱细胞技术，研究出能够仅仅脱去细胞而不破坏其结构，并最大限度减少副作用的方法。

2.1.2 纤维蛋白

纤维蛋白是ECM 的重要组成成分，也是组织损伤后形成的机械支撑结构，有利于细胞的黏附、增殖、迁移和分化[20]。纤维蛋白具有良好的生物相容性、细胞亲和性、可塑性、能和其他不同材料良好结合、易于植入等优点。同时，由于其前体（纤维蛋白原和凝血酶原）可从患者血液中获取，可避免免疫排斥反应。研究发现，将大鼠心肌细胞与纤维蛋白水凝胶结合后，可形成极薄且具有功能的心肌补片，可作为心肌补片支架的来源。目前，利用EMSCs 与纤维蛋白支架结合形成的心肌补片已进行了临床试验[7]，验证了纤维蛋白支架补片的安全性与可行性。

2.1.3 胶原纤维

胶原纤维是细胞外基质的主要成分，包括胶原纤维Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中常用的是胶原纤维Ⅰ型，可提供与正常生理环境相似的胞外微环境，有较好的生物相容性及降解性，且不会引起较大的免疫排斥反应。Wendel 等[21]将人来源iPSCs诱导产生的心肌细胞（hiPS-CM）和周细胞结合胶原纤维凝胶制成补片，植入到急性心梗大鼠心脏中，4 周后观察到心梗面积减少了18%，射血分数增加了20%，且补片中出现胶原纤维沉积和新生血管，表明产生了天然细胞外基质和新的血管。但胶原纤维的伸缩性较差，需与其他材料结合增强机械性能。但从实际应用角度而言，其获取加工过程复杂，并不是心肌补片支架的最佳选择。

2.1.4 明胶

明胶是一种可吸收的生物材料，来自于胶原蛋白，故其化学特性和胶原纤维相似，制作成本低，且细胞贴附性好，细胞与其结合存活率高[22]。明胶拉伸强度低，易快速变形，较少单独使用。通过与甲基丙烯酰胺交联的明胶（GelMA）具有多孔结构，机械性能与正常心肌组织相似，有利于心肌细胞的生长贴附[23]。但明胶的导电性较差，常需与其他材料结合以提高导电性。将甲基丙烯酰明胶结合导电性极强的基于胆碱的生物粒子液体（bio-IL）制成的心肌补片，能够在提供机械支持恢复肌电耦合的情况下，最大限度地减少心肌重塑，维持正常心功能[24]。

2.1.5 藻朊酸盐

藻朊酸盐是形成褐藻类细胞膜的物质，能在冷水中变成黏稠溶液，具有极好的成膜能力。这种原位凝结能力使其具有良好的可塑性，更易形成所需的支架结构，能形成多孔结构，而多孔结构支架更加稳定，具有更好的机械性能，也更利于细胞的生长黏附，并能引导细胞生长，使其具有导向性[25]。利用3D 多孔藻朊酸盐支架结合胎儿心肌细胞形成补片，移植于心梗大鼠体内，观察到新生血管生成明显增多，左室扩张和衰竭明显改善，证实了藻朊酸盐心肌补片的可行性[26]。此外，藻朊酸盐具有抗血栓、成本低的优点。

2.1.6 壳聚糖

壳聚糖是一种天然聚合物，是壳类动物骨骼的主要成分之一。因其具有抗菌、抗血栓及促进伤口愈合的作用[27]，在药物治疗方面已经得到了广泛的研究。同时，壳聚糖具有良好的生物相容性、亲水性、机械强度，能够通过脱乙酰度调节降解速率，且能同其他材料进行良好复合，这些优点使其作为心肌补片支架优势显著。研究发现，壳聚糖＋碳酸钙复合形成的支架可通过促进新生血管生成,减少梗死面积，以改善心肌功能[28]。但是，壳聚糖不具有导电性，需同导电性良好的材料结合，以增加其导电性。碳纳米管沉积制备的壳聚糖支架展示出良好的导电性，可使心肌细胞中涉及肌肉收缩和电藕连的基因表达增加[29]。

2.2 合成支架

聚合物材料易于合成、结构稳定、来源多样、制备成本低，且化学结构和组成明确，降解率和结构能够人为地精确控制，是目前最常用的合成支架。常见的聚合物支架有聚乙二醇、聚丙交酯-共-ε-己内酯、聚已内酯、聚乳酸-乙醇酸、聚甘油癸二酸酯等。

2.2.1 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）

PEG 是一种水溶性高、免疫原性低、生物相容性好且无毒的亲水性聚合物。在骨、胰岛、软骨、间充质干细胞等领域的应用已有60 多年历史[30]。PEG 水凝胶补片形成纳米级表面微结构能够模拟天然ECM，观察到心肌细胞在补片上呈导向性生长，可见各向异性动作电位传播和心肌细胞收缩。研究表明，PEG 可通过增强CAVEOLIN 信号传导和抑制G 蛋白偶联受体-2 和β-arrestin 信号，进而保护梗死后缺氧环境下的心肌细胞，抑制心室重构[31]。

2.2.2 聚丙交酯-共-ε-己内酯（Polylactide-co-epsiloncaprolactone，PLCL）

PLCL 是一种具有良好机械性能的可降解聚合物，能够为心梗部位提供良好的机械支撑。因其具有良好的弹性，在韧带、血管、尿道方面的研究较多[32]；又因其具有较高的可塑性、可控的降解速率和较低的细胞毒性，使其成为组织工程心肌补片支架材料的良好选择。利用PLCL 合成的聚合物支架结合MSCs 的心肌补片治疗心梗大鼠，其左室射血分数提高了18%，心梗面积减少了29%，表明心功能明显改善[33]。但是，该材料生物相容性差，需与其他材料结合以提高其生物相容性，进而促进细胞的黏附和增殖。

2.2.3 聚已内酯（Polycaprolactone，PCL）

PCL 是一种可降解的合成化合物，其应用已较为成熟。

PCL 拉伸强度大，机械性能好，免疫原性低，降解缓慢，且能对药物进行缓慢释放。但是，PCL 亲水性较差，不利于细胞的贴附，需结合其他材料来提高其亲水性[34]。研究发现，用氢氧化钠处理过的PCL 亲水性显著提高，细胞与材料的贴附更好，自发搏动能力显著提高。同时，通过与导电聚合物聚吡咯结合，可增加PCL 的导电性，增强基质传导性[35]，对于补片细胞获得正常的电生理功能具有重大意义。

2.2.4 聚乳酸-乙醇酸（Polylactic acid-glycolic acid，PLGA）

PLGA 是由PLA 和PGA 合成的材料，具有更好的机械性能，分子量可控，降解率可调节，可形成各种形状和大小的支架材料，在诸多领域已有广泛应用[36]。利用静电纺丝技术合成的具有各向异性的三维PLGA 支架可成功诱导大鼠心肌细胞导向性生长，并呈现出良好的搏动性[37]。研究发现，人胚胎来源的心肌细胞能够在PLGA 可降解薄膜支架上各向异性贴附生长，且明显降低了心律失常的发生率[38]。

2.2.5 聚甘油癸二酸酯（polyglycerol sebacate，PGS）

PGS 是一种相对较新的弹性聚合物，由于生物相容性好、弹性好、硬度大、亲水性好、细胞贴附性好、易于合成、制作成本较低，且对细胞增殖有一定的促进作用[39]，是最具临床应用潜能的心肌补片材料之一。但是，PGS 降解速率快，分子量低，需要高温进行真空交联；另外，PGS 不能进行静电纺丝。PGS 需通过和其他材料的结合来弥补上述缺点。例如，与PCL 结合形成的复合物补片可以同VEGF 共价固定，在为心肌细胞提供机械支持的情况下，促进新生血管的生成，更加有利于心肌梗死的修复[40]。

2.3 支架制备技术

制备理想的组织工程支架要求研究出一套成熟而高效的技术。目前常用的技术包括脱细胞法、静电纺丝技术、分子自组装、生物打印技术等。

2.3.1 脱细胞法

天然支架主要通过脱细胞法制备，包括物理方法（低温）、化学方法（去污剂，酸碱）和生物方法（消化酶）[41]。通过脱细胞法制备的心肌补片支架具有足够的机械力量，保留了血管等微结构和一些有助于细胞生长的生物成分。但无论通过何种方法脱细胞，残留的细胞碎片仍会引起免疫排斥反应和影响内源性修复，并导致机械性能的改变。另外，在脱细胞过程中，可能会生成一些不利于细胞生长的物质，而导致支架产生一定的细胞毒性。脱细胞支架已经在小肠、膀胱等领域进行了广泛的研究，在心血管疾病的治疗也已开展了应用，其中包括梗死后心肌的修复治疗。

2.3.2 静电纺丝技术

静电纺丝技术是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形（即“泰勒锥”），并从圆锥尖端延展得到纤维细丝。该方法可生产出纳米级的聚合物细丝[42]。作为组织工程材料的常用技术，静电纺丝技术能合成与天然细胞外基质相似的微结构，通过调控溶液浓度、流速、喷射高度等参数，可合成所需的多孔、纤维直径可控的支架，以及纺制出有序排列微结构的材料。这种有序排列结构有利于心肌细胞的导向性生长，最终形成类似于正常心肌细胞的排列方式，有利于心肌细胞的电传导和一致性收缩。这种技术对材料成分和尺寸具有较强可控性，且该技术易于掌握，使其成为组织工程中最常用的技术。该技术的局限性在于其喷射状态不稳定，形成的纤维均一度欠佳。

2.3.3 分子自组装

分子自组装是在平衡条件下，分子自发地通过非共价键连接结合，形成稳定的、结构明确的聚集体[43]。自组装程序发生通常会将系统状态从无序转变成有序。分子自组装常用的材料是多肽，用于分子自组装的多肽主要有α-螺旋肽、β-片层肽和仿制胶原肽，其中的β-片层肽是最常见的。利用分子自组装形成的纳米纤维支架结合心肌细胞形成的纤维支架，可减轻心肌梗死部位的心肌坏死[44]。分子自组装肽具有自我识别、降解产物无毒等优点。与静电纺丝技术相比，分子自组装能够形成更精细的支架结构，细丝直径可达10 nm，更利于细胞的黏附、增殖分化，以及梗死心肌部位的修复。但自组装肽机械性能相对较弱，故可与机械性能较好的材料结合。

2.3.4 生物打印技术

生物打印技术是指将细胞、生长因子和支架结合成整体，通过三者之间的相互作用实现组织的功能化[45]。目前，生物打印技术主要包括挤出式、喷墨式和激光辅助3 种，各有优缺点。挤压式是最常用的，速度最快，更适用于大规模打印，还可打印载有细胞的微球以及细胞外基质。该方法对细胞损害最小，但打印精度有限，形成的细丝最小尺寸约100 nm；同时，该方法对墨水具有较高要求。喷墨式打印技术优势在于活细胞数量比例更高，成本更低，但细胞分散程度无法保证，且对墨水浓度也有一定要求。激光式打印能保证较高的精确度，且对墨水要求较低，但不适合多种细胞混合打印，并且对细胞伤害较大，使得活细胞数量较其他两种打印方式更少。生物打印技术能够对支架结构进行精确控制，灵活性好、可测量、可短时间可大量打印，是医疗行业的革命性技术，在组织工程心肌补片发展中具有良好的应用前景。

3 影响心肌补片构建的因素

理想的心肌补片能在移植后完全模拟正常的心肌组织，替代梗死组织。除了基本的细胞和支架问题，还需考虑补片的厚度、血供以及梗死微环境对补片的影响。

3.1 厚度与血供

心脏补片的厚度是最关键的问题。为了给梗死心肌提供更好的机械支持，目前的研究正聚焦于厚补片的制备方法。由于氧气扩散和营养供给的问题，心脏补片的厚度受到限制。心肌存活需要充足的血供，需建立循环支架心肌补片，促进血管的生成。大量研究尝试在移植补片中装载生长因子，包括血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子，通过对这些生物活性因子进行缓释，来达到促进新生血管生成，进而提高心肌细胞的存活率，减少梗死区域面积，提高心功能的目的[46]。此外，还有研究尝试利用多层补片叠加的方法来制备模块化的心肌补片，每一模块都有独立的功能，包括促进血管生成、减少免疫反应等，从而使得模块化的心肌补片的综合厚度达到期望值[47]。

3.2 导电性

心脏通过传导系统将冲动传导到心脏的各个部位而产生收缩舒张功能。因此，心肌的电活动对于心功能具有至关重要的意义。因此，心肌补片应具有良好的导电性，常通过在补片中添加导电性强的离子来增加补片的导电性（如碳纳米管、石墨烯和某些金属粒子）。研究发现，碳纳米管作为一种纳米材料，具有良好的机械性能、超强的导电性、良好的化学稳定性和热稳定性。将碳纳米管填充到心肌补片支架中，既弥补了天然以及合成材料导电性不足的缺点，还能提高支架的机械性能及稳定性[48]。带有多功能电子设备的静电纺丝纤维补片，能够在记录补片电活动的同时不影响补片的功能，在补片修复梗死心肌的过程中可监控补片细胞的电活动[49]。

3.3 微环境对组织工程产物的影响

细胞微环境对细胞的增殖、分化及代谢起着十分重要的作用。研究发现，在梗死后心脏缺血缺氧微环境中，心肌旁分泌的活性因子对心肌修复具有至关重要的作用。这些细胞因子能促进炎症发生，如促炎症因子IL-1、TNF、IL-6 和IL-18。炎症发生对梗死修复有利有弊，如下调肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）的表达，梗死区域面积减小，白细胞浸润降低，对心肌梗死的治疗起到积极作用。但时，也有研究发现，TNF 缺乏时，心肌缺血性损伤更加明显，细胞凋亡同时增多，进一步加重心梗病情的发展[50]。虽然心肌梗死后细胞微环境的变化及其作用机制尚未完全清楚，但可通过对细胞因子表达的控制来促进梗死心脏的修复。

4 总结与展望

目前，利用组织工程心肌补片治疗心梗最主要的问题仍是细胞黏附和存活率问题。心肌补片治疗方式虽移植了大量心肌细胞，但最终能存活下来并发挥作用的细胞与梗死区域的需求存在较大差距。此外，天然支架和聚合物支架各有优势，为了更好地在补片中发挥作用，多种材料的复合支架似乎是未来支架材料的良好选择。因此，选择合适的细胞支架不仅要充分考虑支架的优良性能，还要考虑影响心肌补片在体内外发挥作用的各种因素及相关作用机制。此外，如何保证在细胞培养分化移植等过程中的无菌操作、采取何种方法进行移植，以及移植后如何对移植的细胞进行检测和实时监控等问题都亟待解决。由于上述问题还未得到充分解决，目前对于心肌梗死组织工程治疗的临床试验还主要停留在细胞注射阶段[51]，暂无临床研究证实心肌补片治疗心梗的有效性。要实现通过组织工程心肌补片对心梗进行治疗，许多方面还需要更深层次的研究。