基于一测多评法的白术饮片成分含量测定

伍蕊嗣， 刘 涛， 梁 悦， 周蔚昕， 寇 强， 张 佳

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

白术为菊科植物白术的干燥根茎，主要含挥发油、内酯类和多糖类成分，具有健脾益气、燥湿利水等功能，始载于《神农本草经》，主产于浙江、安徽、淮北、皖南等地[1].《中国药典》2015年版一部中白术项下无含量测定项，难以体现和保障白术的内在品质及其相关制剂的质量[2].目前虽已有以多个成分同步测定或利用液相指纹图谱来控制白术质量的相关报道，但由于化学对照品紧缺、价格昂贵且不稳定，而利用指纹图谱无法定量测定白术含量，这些都限制了这些质控模式的实际应用[3-6].此前，有学者提出一测多评法，即只采用一个对照品实现对药材多种成分含量的同步测定[7-9].因该法具有代表性而被《中国药典》2015 年版一部收载，并在丹参、人参、黄连等药材中得到应用.基于此，本研究拟采用一测多评法，以白术内酯I、白术内酯III和苍术酮多个有效成分为指标对白术饮片进行多成分含量测定，利用一个白术内酯III为对照品，通过相对校正因子的计算，同步实现多成分(白术内酯I、苍术酮)的含量测定，拟为白术质量标准的可控提供技术保障.

1 材料与仪器

1.1 材 料

1)实验所用白术为本实验室2017年从浙江、四川、河北购买的13批栽培品，样品经成都大学药学与工程学院刘涛研究员鉴定为菊科植物白术的干燥根茎.

2)实验所用的试剂包括：白术内酯I(批号，wkq16052904，纯度≥98%)、白术内酯III(批号，wkq16092604，纯度≥98%)，购自四川省维克奇生物科技有限公司；苍术酮(批号，170107，纯度为85%，计算时按100%折算)，购自成都植标化纯生物技术有限公司.实验所用甲醇、乙腈为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：P230Ⅱ型高效液相色谱仪、Ichrom 5100型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；FA2004型分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；HS-3120型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司).

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 色谱条件.

本研究参照相关文献对白术饮片一测多评法的色谱条件(流动相、检测波长)进行了考察，最终确定实验的色谱条件为：依利特Supersil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)—水溶液(B)；梯度洗脱程序为，0～20 min，62% A，20～21 min，62%～80% A，21～40 min，80% A，40～41 min，80%～62% A，41～50 min，62% A；流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长220 nm，进样量10 μL.在以上色谱条件下，苍术酮、白术内酯I、白术内酯III分离度良好，结果如图1所示.

1.白术内酯III； 2.白术内酯I； 3.苍术酮

图1对照品(A)和供试品(B)的高效液相色谱图

2.1.2 混合对照品溶液的制备.

精密称定苍术酮、白术内酯I、白术内酯III对照品适量，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为0.6848 mg/mL、0.8488 mg/mL及0.6343 mg/mL的单一对照品溶液.

精密吸取以上3种对照品溶液，加甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度分别为0.0240 mg/mL、0.0170 mg/mL及0.1097 mg/mL的混合对照品溶液.

精密吸取1.0 mL混合对照品溶液4份，分别置于5、10、25、50 mL容量瓶中，加甲醇定容摇匀，依次作为混合对照品溶液2～5.

2.1.3 供试品溶液的制备.

取白术粉末(过2号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，称定质量，超声处理10 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，作为供试品溶液.

2.1.4 线性关系考察.

取“2.1.2"项下 5 个浓度梯度的混合对照品溶液，按照“2.1.1"项下的色谱条件.对峰面积(Y)和进样量(X)进行线性回归，分别得到苍术酮、白术内酯I、白术内酯III的回归方程及线性范围(见表1).结果表明，混合对照品溶液在各自线性范围内线性关系良好.

表1 白术饮片中3个成分的标准曲线

2.1.5 精密度.

按照“2.1.1"项下的色谱条件，连续进样混合对照品溶液2号6次，苍术酮、白术内酯I和白术内酯III峰面积的RSD分别为0.93%、2.42%、1.37%.结果表明，仪器的精密度良好.

2.1.6 稳定性.

按照“2.1.3"项下的方法制备供试品溶液，于样品制备后的第0、2、4、6、8、12 h，在“2.1.1"项的色谱条件下进行测定，苍术酮、白术内酯I和白术内酯III峰面积的RSD分别为4.78%、4.77%、4.70%.结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好.

2.1.7 重复性.

按照“2.1.3"项下的方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1"项的色谱条件下进行测定，苍术酮、白术内酯I和白术内酯III含量的RSD分别为1.70%、3.32%、1.70%.结果表明，方法的重复性良好.

2.1.8 加样回收.

取已知含量的白术粉末(过二号筛)约0.25 g，精密称定，按含量—对照品(1∶1) 的比例分别加入3种对照品溶液适量，按照“2.1.3"项下的方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1"项的色谱条件下进行测定，苍术酮、白术内酯I和白术内酯III的加样回收率分别为105.22%、104.60%、94.92%，含量的RSD分别为1.45%、2.44%、4.59%.结果表明，方法的回收率良好.

表2 加样回收实验结果

2.2 相对校正因子确定

依据相关计算公式，分别计算白术内酯I和苍术酮相对于白术内酯III(内参物)的相对校正因子，结果见表3.

表3 白术饮片中3个成分相对校正因子

2.3 白术饮片一测多评法的适应性评价

2.3.1 不同仪器的影响.

在同一实验室，采用同一色谱柱(依利特Supersil C18)，考察了2种高效液相色谱仪(P230II型、Ichrom 5100型)对相对校正因子的影响，结果见表4.数据显示，f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ的RSD均小于5 %.结果表明，相对校正因子在这2种高效液相色谱仪下重复性良好.

表4 2种高效色谱仪测得相对校正因子

2.3.2 不同色谱柱的影响.

在同一实验室，采用2种高效液相色谱仪(P230II型、Ichrom 5100型)，分别考察了2种色谱柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)对相对校正因子的影响，结果见表5、6.

表5 不同色谱柱测得相对校正因子——P230Ⅱ

表6 不同色谱柱测得相对校正因子——Ichrom 5100

表5、6数据显示，f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ的RSD均小于2%.结果表明，相对校正因子在这2种高效液相色谱仪下2种色谱柱间的重现性良好.

2.3.3 不同柱温的影响.

在同一实验室，采用同一色谱柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色谱仪(Ichrom 5100型)下，考察3种柱温(30、35、40 ℃)对相对校正因子的影响，结果见表7.

表7 不同柱温对相对校正因子的影响

表7数据显示，f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ的RSD均小于2%.结果表明，各成分相对校正因子重现性良好.

2.3.4 不同流速的影响.

在同一实验室，采用同一色谱柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色谱仪(Ichrom 5100型)下，考察了3种流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)对相对校正因子的影响，结果见表8.

表8 不同流速对相对校正因子的影响

表8数据显示，f白术内酯Ⅰ/白术内酯Ⅲ、f苍术酮/白术内酯Ⅲ的RSD均小于3%.结果表明，各成分相对校正因子重现性良好.

2.4 一测多评法待测色谱峰的定位

在同一实验室，分别考察了2种高效液相色谱仪(P230Ⅱ型、Ichrom 5100型)，2种色谱柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)下相对保留值和相对时间差的重现性，结果见表9、10.

表9 一测多评法待测成分色谱峰的定位(相对保留值)

表10 一测多评法待测成分色谱峰的定位(相对时间差)

表9、10数据显示，相对保留值(RSD<2%)较相对时间差(RSD<4%)更能定位色谱峰.

2.5 一测多评法与外标法测定结果的比较

按照“2.1.3"项下的方法制备供试品溶液，在“2.1.1"项的色谱条件下，采用外标法测得白术内酯III的含量，再通过一测多评法与外标法测得苍术酮和白术内酯I的含量，将两种方法所得结果进行比较，结果见表11.

表11 外标法与一测多评法测定白术饮片中3种成分结果比较

由表11数据可见，在13批白术饮片中，2种方法所测得成分含量的RSD均小于5%.此表明，本研究建立的一测多评法能替代外标法对白术饮片进行含量控制.

3 讨 论

白术作为临床常用中药，一直是行业研究的重点，而《中国药典》2015年版一部中白术无含量测定项的收载.目前，还没有发现对白术饮片利用一测多评法的报道，只有多成分同时测定和液相指纹图谱的相关研究.但由于化学对照品紧缺和价格昂贵，指纹图谱无法定量测定含量，限制了这些质控模式的实际应用.

苍术酮、白术内酯I、白术内酯II、白术内酯III是白术中的主要特征性成分，药理活性显著，且与白术的功效具有相关性，是评价白术饮片质量的适宜指标.但本研究在实验过程中发现白术内酯Ⅱ极不稳定，其稳定性和精密度均不能达到要求，故只对白术饮片中白术内酯I、白术内酯III、苍术酮成分进行一测多评法的研究，之所以选择白术内酯III作为内参物是由于它在白术饮片中的含量高于白术内酯I，而苍术酮对照品难以制备且价格昂贵，故本实验选择性质稳定且价格适中的白术内酯III作为内参物.本次实验中使用的苍术酮对照品纯度为85%，在实验过程中的含量按100%折算.

同时，本研究还对白术饮片一测多评法的供试品制备条件进行了考察：溶媒(甲醇、95%乙醇、水)；溶媒倍数(20、40、80倍)；超声时间(10、20、30 min)，以峰面积加权评分法确定了“2.1.3”项下的供试液制备方法.对不同的色谱条件进行考察后确定了“2.1.1”项下的色谱条件，在该色谱条件下，各待测成分分离度良好，达到基线分离.

此外，本研究以白术内酯III为内参物，建立白术内酯I、苍术酮相对白术内酯III的相对校正因子，先得到白术饮片中白术内酯III的含量(外标法)，进而计算得到白术内酯I、苍术酮的含量(相对校正因子).通过对13批白术饮片的含量测定发现，一测多评法和外标法两法所得数值间RSD<5%.白术饮片一测多评法的准确度、重复性、稳定性及精密度均较好.相对保留值较相对时间差能更好地定位色谱峰，RSD<2%.另外，为了确定白术饮片一测多评法的适应性，分别考察了2种高效色谱仪(P230II型、Ichrom 5100型)、2种型号色谱柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)、3种柱温(30、35、40 ℃)、3种流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)对相对校正因子的影响.但由于实验条件的限制，没有采用更多型号或类别的液相色谱仪和色谱柱进行验证，耐用性和系统适应性有待进一步研究.实验结果表明，本研究建立的一测多评法可同时简便快速准确地测定白术饮片中主要及有效成分(苍术酮、白术内酯I、白术内酯III)的含量，能用于白术饮片含量的控制.