基于紫外—可见与红外指纹图谱的金银花与山银花品质差异研究

刘 涛, 郑 燕, 杨 丹， 曹 鑫, 杨俊莉, 张 佳, 徐玉玲

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1].研究表明，金银花具有抑菌、抗病毒、解热、保肝、降血脂及抗化免疫调节等作用[2].山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1].研究发现，山银花具有抑菌、抗病毒、抗过敏和肝脏保护等作用[3].

《中国药典》自2005年版起将金银花和山银花分为两个品种收载.在南方大部分地区，民间仍然习惯将山银花称为金银花.在药材市场，山银花常被用来替代金银花入药，但《中国药典》2015版规定，只有忍冬为金银花的惟一合法来源.针对金银花与山银花中的差异，科研人员进行了相关的研究，取得了一系列成果[4-6].在此基础上，本研究通过建立金银花与山银花的紫外—可见与红外指纹图谱，在不同波长下对二者成分及其官能团进行分析，完善了金银花与山银花质量控制差异的研究方法.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用的材料包括：无水乙醇(批号，2016102401)、石油醚(批号，2016091301)、甲醇(批号，2017010501)，均购自成都科龙化工试剂厂，溴化钾(批号，20170526)，购自天津卒越化学品有限公司；水为蓝光纯净水；金银花、山银花药材购置于不同中药店，经四川省中医药科学院李青苗副研究员鉴定，药材金银花为忍冬，药材山银花为灰毡毛忍冬，样品来源分别见表1、2.

表1 金银花药材来源

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：TU-1810PC型紫外—可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Spectrum Tow型红外光谱仪(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型电子天平(上海友声衡器有限公司)；FW-5型压片机(天津博天胜达科技发展有限公司)；LD510-2R型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司)；HS-3120型超声清洗器(天津恒奥科技发展有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公司).

表2 山银花药材来源

2 方法与结果

2.1 紫外—可见指纹图谱

2.1.1 供试品溶液制备.

取金银花、山银花粉末各约0.6 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称定质量，超声处理 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得.

2.1.2 测试条件.

以甲醇调整基线并作为参比液进行紫外—可见光谱测定，设定扫描波长为200～900 nm，扫描速度 200 nm/min，狭缝宽1.5 nm，采样间隔2 nm.

2.1.3 方法学考察.

按“2.1.1"项下方法制备金银花供试品溶液1份，取供试品溶液，利用波长为200～900 nm的光谱进行全波长扫描，得到图谱后，用样品的吸收波长计算平均相对标准偏差RSD，测得精密度、稳定性、重复性考察项下紫外—可见图谱波长在329 nm、265 nm、242 nm、230 nm、217 nm处的RSD均小于5.0%.结果表明，方法的精密度、稳定性、重复性均良好.

2.1.4 金银花与山银花紫外—可见光谱采集.

分别取10批金银花药材粉末与10批山银花药材粉末，按照“2.1.1"项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.2"项下条件测定.10批金银花药材叠加图谱见图1，10批山银花药材叠加图谱见图2.

2.1.5 金银花对照紫外—可见指纹图谱的建立.

选择在前期研究中进行构建指纹图谱的10批金银花样品(编号，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10)，以其吸收波长下，吸光度的平均值为对照指纹图谱的吸收强度，得到对照紫外—可见图谱如图3所示.

图1 10批金银花紫外—可见光谱叠加图

图2 10批山银花紫外—可见光谱叠加图

图3金银花对照紫外—可见指纹图谱

2.1.6 样品指纹图谱相似度分析.

将山银花样品的紫外—可见图谱与得到的对照紫外—可见指纹图谱进行相似度分析，采用相关系数法[7-8]进行计算，结果见表3.

表3 相似度分析结果

由表3可知，山银花指纹图谱与金银花对照指纹图谱的相似度在96.4%～98.7%范围内.此表明，金银花药材与山银花药材的内在质量有较高的相似性.

2.1.7 结果分析.

由图1、图2可以观察到，金银花的吸光度范围大致在0.214～1.098之间，山银花的吸光度范围大致在0.150～1.400之间，并且金银花与山银花在波长329 nm处都有一波峰，在波长265 nm处都有一波谷，金银花在波长230 nm、242 nm处有一波峰，山银花在这两处峰形不太明显，但两药材在波长217 nm处都有一波峰.

研究证实，在波长329 nm处有特征吸收峰的是亚异丙基丙酮类化合物，在波长230 nm处有特征吸收峰的是芳香族化合物，在波长242 nm处有特征吸收波峰的是甾体类化合物，在波长217 nm处有特征吸收峰的是1,3-己二烯类化合物.此表明，金银花与山银花都含有亚异丙基丙酮类化合物和1,3-己二烯类化合物；金银花含有甾体类化合物和芳香族化合物，但山银花可能含有少量或不含有.

2.2 红外指纹图谱

首先测定金银花、山银花药材粉末红外指纹图谱，再以不同极性的甲醇、水、石油醚为溶媒制备供试品溶液，再测定其红外指纹图谱，目的是排除不同极性溶媒对图谱产生的影响.由于紫外—可见指纹图谱供试品制备以甲醇为溶媒，最后选择以甲醇为溶媒的金银花与山银花红外指纹图谱进行共有峰率及变异峰率的分析，目的是排除溶媒对两种分析方法产生的影响.

2.2.1 金银花与山银花粉末红外图谱采集.

分别取适量金银花、山银花药材粉末于玛瑙乳钵中，加入100 mg溴化钾粉末研磨均匀，取适量研细后的粉末平铺于红外压片模具中，以15 MPa压力压制2 min，将制备好的样片置于红外光谱仪中测定红外光谱，测定区域为450～4 000 cm-1.

2.2.2 3种提取溶媒下供试品红外图谱采集.

取金银花、山银花粉末各约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别平行3份，分别精密加入石油醚、甲醇、水25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用相应的溶媒补足减失的质量，摇匀，滤过，制得供试品溶液.取20 μL供试品溶液于玛瑙乳钵中，挥干，加入100 mg 溴化钾粉末研磨均匀，取适量研细后的粉末平铺于红外压片模具中，以15 MPa压力压制2 min，将制备好的样片置于红外光谱仪中测定红外光谱，测定区域为450～4 000 cm-1.

2.2.3 方法学考察.

取金银花样品(批号，170319)4份，按照“2.2.1"及“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并进行测定，取所得图谱中吸收强度最强的6个对应波数作为特征吸收波数.经考察，测得精密度、重复性、稳定性项下各特征峰波数值RSD均小于1.5%.结果表明，方法的精密度、重复性及稳定性均符合要求.

2.2.4 金银花与山银花红外图谱采集及数据分析.

将10批金银花与山银花药材粉末按“2.2.1”及“2.2.2”项下方法进行测定，得到不同的金银花与山银花红外指纹图谱如图4所示.

cm-1

图4不同处理方法下金银花与山银花红外光谱叠加图

图4中，10批金银花与山银花药材直接压片的红外光谱叠加图谱，见图4(H1)、(H2)；石油醚为提取溶媒的10批金银花与山银花药材红外光谱叠加图谱，见图4(H3)、(H4)；甲醇为提取溶媒10批金银花与山银花药材的红外光谱叠加图谱，见图4(H5)、(H6)；水为提取溶媒10批金银花与山银花药材的红外光谱叠加图谱，见图4(H7)、(H8).

由图4可知：在1 700～700 cm-1指纹区，药材粉末直接压片光谱的吸收峰强度强于溶剂提取物，石油醚提取物吸收峰强度弱于甲醇与水提取物；在3 700～3 000 cm-1指纹区，石油醚提取物吸收峰强度弱于甲醇与水提取物，甲醇与水提取物吸收峰强度较弱于药材粉末直接压片；金银花与山银花的不同极性提取物图谱基本相似.产生以上结果的原因可能是由于3种溶媒极性差异所致，石油醚极性较弱，提取效率较低，甲醇与水极性较强，但较药材粉末直接压片，存在较大差异，表明甲醇与水不能将药材中有效成分提取完全.在红外光谱中，不同溶媒提取的金银花与山银花药材无明显差异，此表明，不同溶媒提取的金银花与山银花有效成分基本相似.

由图4(H1)～(H8)可见，在3 400 cm-1、2 900 cm-1、1 600 cm-1、1 000 cm-1、2 000 cm-1区域附近都存在波谷，在1 500 cm-1、1 200 cm-1、880 cm-1域附近都存在波峰，且金银花红外指纹图谱与山银花红外指纹图谱存在的波峰波谷基本相似，此表明金银花药材与山银花药材内在质量基本相似.经查阅资料，金银花中主要的成分是绿原酸、木犀草苷.绿原酸属于酚酸类，而木犀草苷属于黄酮类，根据其结构式的官能团-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，可以把其红外光谱图分为3 400～2 800 cm-1、1 800～1 100 cm-1、1 100～450 cm-13个区段来研究[9].据图4(H1)～(H8)可知，在金银花与山银花药材中，都含有-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，且成分与含量没有明显差异.

2.2.5 甲醇为提取溶媒的金银花与山银花药材红外指纹图谱数据分析.

共有峰定义为在相互比较的2个红外指纹图谱中都出现的一组吸收峰，且组内吸收峰的最大波数差显著小于其与相邻组之间的平均波数差，反之则为变异峰.共有峰率和变异峰率[10]的表达式为，

Na=Ng+na，Nb=Ng+nb，

式中，Na为指纹图谱a的总峰数；Nb为指纹图谱b的总峰数；na为红外指纹图谱a的变异峰数；nb为红外指纹图谱b的变异峰数；Ng为共有峰数；P为共有峰率；Nd为独立峰数；Pva为指纹图谱a的变异峰率；Pvb为指纹图谱b的变异峰率.

5批金银花样品基本关系组与对如下：

(1)R1∶r1 (25.0,162.5,237.5)，R1∶r2(23.5,150.0,275.0)，R1∶r3(30.4,200.0,128.6)，R1∶r4(18.8,133.3,400.0)，R1∶r5(32.0,100.0,212.5)

(2)R2∶r1(50.0,30.0,170.0)，R2∶r2(36.0,44.4,233.3)，R2∶r3(64.3,44.4,111.1)，R2∶r4(40.6,0,246.2)，R2∶r5(40.9,44.4,200.0)

(3)R3∶r1(55.6,20.0,160.0)，R3∶r2(30.8,50.0,275.0)，R3∶r3(81.8,33.3,88.9)，R3∶r4(31.4,9.1,309.1)，R3∶r5(52.6,20.0,170.0)

(4)R4∶r1(210.0,19.0,28.6)，R4∶r2(65.2,60.0,93.3)，R4∶r3(75.0,100.0,33.3)，R4∶r4(77.8,14.2,114.3)，R4∶r5(94.0，41.2,64.7)

(5)R5∶r1(38.5,90.0,170.0)，R5∶r2(100.0,12.5,87.5)，R5∶r3(66.7,80.0,70.0)，R5∶r4(58.6,5.9,164.7)，R5∶r5(60.0,50.0,166.7).

其中，R1∶r1(25.0,162.5,237.5)，R1与r1的共有峰率为25.0%，R1相对于r1的变异峰率为162.5%，即金银花变异峰率为162.5%，r1相对于R1的变异峰率为237.5%，即山银花变导峰率为237.5%.

在(1)组中，上述试验结果表明，金银花样品R1与山银花r1～r5的相似度较低，共有峰均小于35%，且每组数据中金银花变异峰率与山银花变异峰率均大于共有峰率，表明金银花样品R1与山银花样品r1～r5的内在质量差异较大；第(2)组与第(3)组共有峰最大值为81.8%，每组数据中金银花与山银花变异峰率至少一项大于共有峰率.表明金银花样品R2、R3与山银花样品r1～r5的内在质量差异较大；在第(4)组与第(5)组中，除R4∶r1组与R5∶r2组共有峰率大于100.0%外，其余每组数据中金银花与山银花变异峰率至少一项大于共有峰率.表明金银花样品R4、R5与山银花样品r1～r5的内在质量存在差异，但较金银花样品R1～R3与山银花样品r1～r5的内在质量差异小.

通过计算5批金银花与山银花药材的共有峰率与变异峰率发现，不同批号金银花药材与山银花药材的共有峰率与变异峰率大小不一.数据(1)～(3)组的分析结果表明，金银花药材R1～R3与山银花药材r1～r5的内在质量存在较大差异；数据(4)～(5)组的分析结果表明，金银花药材R4、R5与山银花药材r1～r5的内在质量存在差异，但内在质量差异较金银花药材R1～R3与山银花药材r1～r5小.可以认为，金银花、山银花药材的质量差异来源于金银花与山银花药材自身存在的差异.因此，以化学成分或单个波长下的指纹图谱比较金银花和山银花的差异应该考虑药材自身的差异对实验结果造成的影响，而目前已有的研究文献缺少对这方面的分析.

3 结 论

本研究通过构建金银花与山银花样品紫外—可见指纹图谱发现，金银花药材与山银花药材的内在质量基本相似.红外光谱分析表明，金银花药材与山银花药材的内在质量存在一定差异.本研究认为，目前金银花与山银花药材的质量控制仍不够完善，在临床用药时，应加强对两者的相关检控.同时，本研究所用方法可为其他种属相近的中药材之间的对比研究提供新的思路.