浙贝母原产地及其迁地引种后含量分析

2019-01-02练心洁孙佑玲张艳容

成都大学学报（自然科学版） 2018年4期

雨田，练心洁，孙佑玲，刘凤，张艳容，周浓

(1.成都大学医学院，四川成都 610106； 2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都 610106；3.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404000)

0 引言

浙贝母为百合科贝母属植物，以其干燥鳞茎入药，是浙江道地药材，主要功效为止咳祛痰，在众多治疗咳嗽的方剂及中成药中广泛使用[1-2].目前，野生浙贝母仅分布于浙江，而人工栽培品种除浙江外，在江苏、上海及福建等地也有种植[3-4].浙贝母生长习性喜湿忌旱、涝，对土质有较严格的要求，且土质、水分、温度和光照等因素均可能对浙贝母生长产生影响，进而决定浙贝母的品质和产量[5-6].对此，本研究采集了浙江东阳等7个原产地的浙贝母，并在重庆地区进行栽培，对其进行贝母素甲、贝母素乙、贝母辛及总生物碱等有效成分的含量测定及差异分析，并基于有效成分含量测定结果筛选出适合重庆地区栽培的浙贝母种源.

1 材料仪器

1.1 材料与试剂

1)实验所用浙贝母于2014年5月期间采自浙江省东阳市千祥镇东王村等7个种植基地，所有样品经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科贝母属植物浙贝母的鳞茎(见表1).

2)实验所用试剂包括：贝母素甲对照品(批号，B20080)、贝母素乙对照品(批号，B20081)、贝母辛对照品(批号，B20082)，购自上海源叶生物科技有限公司，乙腈色谱纯(美国Fiser公司)；甲醇(批号，M813895)、三氯甲烷(批号，B139244)，购自天津恒兴化学试剂公司，水为娃哈哈牌纯净水，其余试剂均为分析纯.

表1样品来源

No.采集地经纬度海拔/m采集日期S1浙江省东阳市千祥镇东王村120°06′49″/29°01′57″1692014.05.14S2浙江省磐安县尚湖镇小坑门村120°38′24″/29°06′58″4862014.05.15S3浙江省磐安县仁川镇方山村120°42′55″/28°89′59″5022014.05.14S4浙江省磐安县新渥镇古竹村120°23′27″/28°57′02″3502014.05.13S5浙江省磐安县仁川镇半坑村120°26′27″/28°53′11″5412014.05.15S6安徽省芜湖县花桥镇苗育村118°37′02″/31°15′13″1 4002014.05.11S7江苏省通州区张芝镇启桥村121°01′17″/31°56′27″142014.05.08

1.2 仪器与设备

实验所用仪器包括：LC-20D型高效液相色谱仪(岛津公司)；KH-5205D型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；CP-224C型分析天平(奥豪斯仪器有限公司).

2 方法

2.1 浙贝母总生物碱的测定

2.1.1 对照品溶液制备.

取贝母素甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.4 mg贝母素甲的溶液，制得对照品溶液.

2.1.2 供试品溶液制备.

取本品干燥粉末(过六号筛)约2 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入浓氨试液4 mL浸泡1 h，精密加入三氯甲烷—甲醇(4∶1)混合溶液50 mL，称定质量，于85 ℃水浴中加热回流2 h，取出，自然冷却至室温，补足减失的质量，滤过.精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中水浴挥干，残渣加少量甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得供试品溶液.

2.1.3 标准曲线的绘制.

分别精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置50 mL具塞锥形瓶中，水浴挥干，精密加入邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲液(pH值5.0)5 mL、显色剂溶液4 mL，振摇混匀，再精密加入三氯甲烷15 mL，振摇后转移至分液漏斗中，静置1 h.以三氯甲烷试剂为空白，在410 nm波长处测定吸光度，以吸光度值(A)为纵坐标，贝母素甲浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为，A=0.0353C-0.0537(r=0.9994).结果表明，贝母素甲对照品在4.0～28.0 μg/mL范围内线性关系良好.

2.1.4 样品含量测定.

精密量取“2.1.2”项下供试品溶液1.0～3.0 mL，置50 mL锥形瓶中，水浴挥干溶剂，按照“2.3.1”项下，自“精密加入邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲液(pH值5.0)5 mL”起，依法测定吸光度，代入标准曲线计算供试品中贝母素甲的质量(mg).本品总生物碱含量以贝母素甲计算[7]，结果见表2.

表2 浙贝母原产地及其迁地引种后浙贝母总生物碱含量(mg/g)

注：*为显著(P<0.05)；**为高度显著(P<0.01).

2.2 浙贝母生物碱的测定

2.2.1 色谱条件.

实验的色谱柱条件为：色谱柱为Durashell C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为A相(乙腈)、B相(0.01 %三乙胺水溶液)；梯度洗脱(0～10 min，30% A，10～15 min，30% A→38% A，15～25 min，38% A→60% A，25～35 min，60% A，35～50 min，60% A→70% A，50～70 min，70% A→90% A)；漂移管温度57 ℃；载气流速2.0 L/min；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温30 ℃.

按照上述色谱条件进行分析，各组分分离度良好，对照品和供试品的HPLC色谱图如图1所示.

1.贝母辛； 2.贝母素甲； 3.贝母素乙

图1混合对照品(A)和供试品(B)HPLC图

2.2.2 对照品溶液的制备.

分别精密称取贝母素甲、贝母素乙和贝母辛对照品适量，溶解于甲醇，制成一定浓度的对照品溶液，备用.

2.2.3 供试品溶液的制备.

精密吸取“2.1.2"项下的供试品溶液10 mL，置蒸发皿中水浴挥干溶剂，残渣加甲醇适量使其溶解，并转移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得供试品溶液.

2.2.4 线性关系考察.

精密称取贝母素甲、贝母素乙和贝母辛对照品适量，溶于甲醇，制成每1 mL分别含贝母素甲0.412 mg、贝母素乙0.304 mg和贝母辛0.452 mg的混合溶液.精密量取此混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量(X)为横坐标，进行线性回归，计算得到贝母素甲、贝母素乙、贝母辛的回归方程分别为:Y=332 543X-365 852(r=0.9996)、Y=207 718X-186 154(r=0.9998)、Y=178 449X-182 918(r=0.9995)，线性范围分别为0.103～0.412 μg/μL、0.076～0.304 μg/μL、0.113～0.452 μg/μL.

2.2.5 样品含量测定.

取浙贝母原产地及其迁地引种后浙贝母药材样品粉末，按“2.2.3"项下的方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，用标准曲线法分别计算各样品中贝母素甲、贝母素乙、贝母辛的含量，结果见表3.

表3 浙贝母原产地及其迁地引种后浙贝母生物碱含量(mg/g)

2.3 结果与分析

1)由浙贝母样品总生物碱含量测定结果及方差分析可知，不同地区栽培的浙贝母中总生物碱含量存在较大的差异，此结果与尹尚军[7]、陈梅梅等[8]的报道相似.浙江东阳(S1)、尚湖小坑门(S2)、仁川方山(S3)、新渥古竹(S4)、安徽花桥(S6)等5地浙贝母经迁地引种后，其总生物碱含量显著上升，其余两地浙贝母该成分含量引种前后未有较大变化.浙贝母总生物碱含量经迁地引种后总体呈上升趋势，证明浙贝母引种后，其主要有效成分与引种前相比，保持稳定或有所增高，该结论是浙贝母引种至重庆地区的重要实验依据.

2)由浙贝母原产地及其迁地引种后浙贝母样品生物碱含量测定结果可知，各地浙贝母引种后生物碱含量与引种前相比均具有差异.仁川半坑(S5)浙贝母经迁地引种后，其贝母素甲和贝母素乙含量分别为0.65%和0.23%，对比引种前分别升高48.65%和28.71%.安徽花桥(S6)的浙贝母经迁地引种后贝母素甲和贝母素乙含量分别为1.47%和0.31%，对比引种前升高502.37%和39.76%.上述两种引种后的浙贝母中生物碱含量均符合《中国药典》(2015年版一部)浙贝母药材项下“含量测定”的限定标准(贝母素甲和贝母素乙的总量不低于0.080%)[1].新渥古竹(S4)地区浙贝母的生物碱含量降低，其总生物碱含量却在上升，这可能与浙贝母中其他生物碱类成分的含量有关，但具体的生物碱种类还有待进一步研究.安徽花桥(S6)浙贝母引种后，总生物碱含量为7个地区最高，且高于浙贝母道地产区浙江，其原因可能与其当地的气候条件、土质和海拔有关[9].但对于总生物碱与单类生物碱成分含量变化的不统一，其内在原因还有待研究.