牛蒡苷元对猪圆环病毒2型感染仔猪体内病毒复制及组织病理影响

2019-01-02吴利军陈夏冰刘晓丽金尔光邵志勇杨文海童伟文杨汉春

畜牧兽医学报 2018年12期

陈洁，吴利军，陈夏冰，刘晓丽，金尔光，邵志勇，杨文海，何斌，童伟文，刘武*，杨汉春

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193； 2.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430208；3.华中农业大学动物医学国家级实验教学示范中心，武汉 430070)

猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属的成员，是迄今发现的一种最小的、无囊膜的、单股环状负链DNA病毒，基因组大小约1.7 kb[1-2]。目前，研究者根据PCV的致病性、抗原性和核苷酸序列将PCV分为PCV1、PCV2和PCV3三种基因型，其中PCV1无致病性，而PCV2和PCV3有较强的致病性[3-4]。其中由PCV2感染引起的猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)是危害当今世界养猪生产的重要免疫抑制性疾病，包括一系列症候群，如仔猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)等[5]。近年来，我国猪群中PCVAD的流行呈现范围广、感染率高、区域性流行显著、存在隐性感染且感染率逐步升高、与其他病原混合感染等特点，使感染猪的病死率大大提高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[6-7]。目前，我国对PCVAD的防控主要依靠疫苗的免疫接种，但是由于病毒在长期的感染过程中极易发生变异和重组，并且PCVAD的发生常常伴随着一种或多种病毒和细菌的混合感染[8-9]，仅仅依靠疫苗的免疫接种，防控效果并不十分理想。中草药作为我国传统医学的宝库具有药源丰富、药物残留低、毒副作用小、促进免疫重建等优点，在畜禽病毒性疾病的防治上具有独特的优势，同时也符合国家畜禽健康养殖的标准，对促进畜牧经济持续健康的发展有十分重大的意义。

牛蒡子(FructusArctii)，始载于《名医别录》，为菊科两年生草本植物牛蒡(AictiumlappaL.)的干燥成熟果实，味辛苦、性寒，归肺胃二经，是一种常用的辛凉解表药,具有疏散风热、解毒透疹、利咽消肿等功效[10-11]。已有的研究表明，牛蒡子的主要活性成分牛蒡苷元(arctigenin, ACT)具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等药理作用[12-15]，能够有效抑制人类免疫缺陷病毒、H1N1流感病毒和流行性乙脑病毒在体内外的转录与复制[16-18]。但是，关于ACT抗PCV2复制的研究鲜有报道。本实验室前期的研究表明，15.6～62.5 μg·mL-1的ACT能够显著抑制PCV2在PK-15细胞上的复制，进一步的小鼠试验表明，腹腔注射0.2 mg·kg-1的ACT能够明显抑制PCV2在小鼠肺、脾、腹股沟淋巴结组织内的复制[19]。本试验在前期工作的基础上，进一步评价ACT对人工感染PCV2仔猪体内病毒复制及组织病理学变化的影响,拟为进一步认识ACT抗PCV2的内在机制及未来抗PCV2中兽药的研制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 毒株

PCV2 WH株(GenBank登录号FJ598044)，由华中农业大学微生物重点实验室惠赠(8.5×1010copies·μL-1)，放置-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

ACT由实验室自备，百分含量≥98%；DMEM培养基和PBS缓冲液购自GIBCO公司；病毒DNA提取试剂盒购自OMEGA公司；定量PCR扩增相关的试剂购自TaKaRa公司；苏木素染液，伊红染液，石蜡购自德国莱卡公司。

1.3 试验动物及试验设计

16头30日龄仔猪(PCV2病原、抗体阴性，PRRSV、SFV病原阴性)随机分成4组(n=4)：给药组1、给药组2、攻毒对照组和空白对照组。给药组1和给药组2分别按照20和50 μg·kg-1剂量给试验仔猪肌内注射ACT，攻毒对照组和空白对照组注射生理盐水，连续注射3 d；第三天肌注后，给药组1、给药组2和攻毒对照组进行PCV2攻毒，攻毒方式为肌内注射2.0 mL·头-1+滴鼻2.0 mL·头-1。空白对照组用生理盐水代替，之后各组恢复正常饲养。

给药前(-2 d)、攻毒前(0 d)以及攻毒后7、14、21 d分别采集猪外周血，采用荧光定量PCR方法检测PCV2核酸拷贝数；攻毒后21 d将试验猪全部剖杀，采集腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体、肺和脾组织进行PCV2核酸拷贝数检测和组织病理学观察。

1.4 组织样品中病毒DNA的提取及定量检测

常规处理组织样品，提取病毒DNA，并按照实验室前期建立的荧光定量PCR方法对组织样品中的PCV2进行定量检测[19]。

1.5 组织病理切片的制作及HE染色

取出多聚甲醛溶液中固定的组织，放入自动脱水机中进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后，进行包埋，然后制成4 μm厚度的切片，应用全自动染色机进行HE染色。

1.6 病理学评分

打乱分组顺序后对切片随机编号，在镜下分别从每头仔猪的同一脏器的3个不同位点取材制作的病理切片中各取3个典型视野拍照。对每个脏器根据病变程度不同分别进行评分，分级标准如表1所示。评分时利用双盲法对每张照片进行病理学评级打分，取3个结果的平均值进行统计学分析。

1.7 数据统计与分析

2 结果

2.1 ACT对PCV2感染仔猪外周血中病毒载量的影响

如图1所示，攻毒后7、14和21 d，攻毒对照组仔猪外周血中的病毒载量明显上升，分别达到9.9×106、2.2×107和5.3×107copies·μL-1，与空白对照组比较，差异极显著(P<0.01或P<0.001)。两个给药组在攻毒7、14和21 d外周血病毒载量相对于空白对照组也有不同程度升高，给药组1(20 μg·kg-1)分别达1.4×104、8.2×103和1.0×105copies·μL-1，给药组2(50 μg·kg-1)达7.2×103、1.1×104和5.8×104copies·μL-1，均显著低于攻毒对照组(P<0.05或P<0.01)，两个给药组外周血病毒载量差异不显著(P>0.05)。

2.2 ACT对PCV2感染仔猪组织中病毒载量的影响

攻毒后21 d将试验仔猪全部剖杀，采集腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体、肺和脾组织，对其中PCV2核酸拷贝数进行荧光定量PCR检测。结果如图2所示，攻毒对照组上述组织中病毒载量分别达到9.3×107、9.3×106、4.0×106、1.4×106和2.6×106copies·μL-1，极显著高于空白对照组(P<0.01或P<0.001)；腹股沟淋巴结中，给药组1(20 μg·kg-1)和给药组2(50 μg·kg-1)的病毒载量分别为5.3×106和1.6×105copies·μL-1，相对于攻毒对照组不同程度降低，其中给药组2极显著低于攻毒对照组(P<0.001)和给药组1(P<0.01)；肠系膜淋巴结中，给药组1和给药组2的病毒载量分别为2.6×105和8.4×104copies·μL-1，分别显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)低于攻毒对照组，两个给药组之间差异不显著(P>0.05)；扁桃体和肺组织中，给药组2的病毒载量均显著低于攻毒对照组(P<0.05)，而给药组1均未显示对病毒复制的抑制作用；脾组织中，虽然给药组2中病毒载量较攻毒对照组降低，但差异不显著(P>0.05)，给药组1未显示病毒载量明显下降(P>0.05)，两个给药组之间差异不显著(P>0.05)。

表1组织病理学评分标准

Table1Histopathologicalclassificationstandard

组织名称Tissue分值Score评分依据Scoring criteria肺 Lung0基本正常1肺泡壁轻度炎性细胞浸润(淋巴细胞和巨噬细胞),肺泡壁未见增厚2明显和广泛的炎性细胞浸润,多灶性肺泡壁轻度增厚(1～2倍)3严重的炎性细胞浸润,多灶性(<25%)肺泡壁轻度至中度增厚(2～3倍)4严重的炎性细胞浸润,多灶性(25%～50%)肺泡壁明显增厚脾 Spleen0基本正常1轻度充血2明显充血,多灶性出血,淋巴细胞轻度减少(<25%)3明显充血,多灶性出血,淋巴细胞明显减少(50%左右)4明显充血,弥漫性出血,淋巴细胞严重减少(>75%)扁桃体 Tonsil0基本正常1轻度充血,多个隐窝上皮细胞轻度变性坏死,脱落2明显充血,多个隐窝上皮细胞轻度变性坏死,脱落,淋巴细胞轻度减少(<25%)3明显充血,多个隐窝上皮细胞明显变性坏死,脱落,淋巴细胞明显减少(50%左右)4明显充血,弥漫性隐窝上皮细胞变性坏死,脱落,淋巴细胞严重减少(>75%)肠系膜淋巴结 0基本正常Mesenteric lymph nodes1轻度充血2明显充血,淋巴细胞轻度减少(<25%)3明显充血,淋巴细胞明显减少(50%左右)4明显充血,淋巴细胞严重减少(>75%)腹股沟淋巴结0基本正常Inguinal lymph nodes1轻度充血2明显充血,淋巴细胞轻度减少(<25%)3明显充血,淋巴细胞明显减少(50%左右)4明显充血,淋巴细胞严重减少(>75%)

*. P<0.05，**.P<0.01，***. P<0.001。下同*. P<0.05，**.P<0.01，***. P<0.001. The same as below图1 ACT对PCV2感染仔猪外周血中病毒载量的影响Fig.1 Effect of ACT on the proliferation of PCV2 in piglet peripheral blood

A.腹股沟淋巴结；B.肠系膜淋巴结;C.扁桃体;D.肺;E.脾A. Inguinal lymph nodes; B. Mesenteric lymph nodes; C. Tonsilla; D. Lung; E. Spleen图2 ACT对PCV2感染仔猪组织中病毒载量的影响Fig.2 qPCR detect the PCV2 copies number in the tissue of piglet

2.3 ACT对PCV2感染仔猪组织器官病理变化的影响

组织病理切片经HE染色后，镜下观察发现，空白对照组仔猪的各器官未见明显病理变化。而攻毒对照组仔猪呈现：肺泡壁毛细血管明显充血，肺泡腔内可见淋巴细胞、脱落的肺泡上皮细胞及巨噬细胞(图3B)；脾严重充血，部分区域出血，淋巴小结内淋巴细胞减少(图3F)；扁桃体黏膜下充血，淋巴小结内淋巴细胞明显坏死(图3J)；肠系膜淋巴结被膜下充血水肿，淋巴小结内淋巴细胞减少(图3N)；腹股沟淋巴结被膜下及小梁周围大量中性粒细胞浸润，淋巴小结内少量的淋巴细胞坏死，伴中性粒细胞浸润(图3R)。

给药组1(20 μg·kg-1)主要呈现部分肺小叶肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞增生及充血(图3C)；脾充血，部分区域出血(图3G)；扁桃体(图3K)、肠系膜淋巴结(图3O)和腹股沟淋巴结(图3S)呈现轻度水肿，淋巴小结内淋巴细胞减少。给药组2(50 μg·kg-1)病理变化较给药组1轻微，仅呈现肺泡壁轻度充血(图3D)；扁桃体黏膜下水肿，少部分淋巴小结内淋巴细胞坏死，中性粒细胞浸润(图3L)；肠系膜淋巴结被膜下略显水肿，少部分淋巴小结内淋巴细胞坏死(图3P)；腹股沟淋巴结髓质内中性粒细胞浸润(图3T)；脾结构清晰，未发现明显病变(图3H)。结果表明两个剂量给药能不同程度减轻PCV2感染导致的仔猪肺、脾、扁桃体、肠系膜淋巴结及腹股沟淋巴结的病理变化。

2.4 ACT给药后PCV2攻毒仔猪组织病理学评分

按“1.6”建立的组织病理学评分标准，对ACT影响下PCV2感染各组仔猪的肺、脾、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结病理切片进行评分并统计分析。结果如图4所示，PCV2攻毒对照组仔猪与空白对照组相比在上述5个器官组织的病理学评分均呈现显著差异(P<0.05或P<0.01)；20 μg·kg-1给药组在肺、脾组织的病理学评分显著低于攻毒对照组(P<0.05)；50 μg·kg-1给药组在5个器官组织的病理学评分均显著低于攻毒对照组(P<0.05)；两个剂量给药组在组织病理学评分上未显示显著差异(P>0.05)。

3 讨论

研究者前期通过体内外试验，发现ACT能够有效抑制PCV2在PK-15细胞和小鼠体内的增殖[19]，而由于PCV2主要在猪群中流行并主要侵害猪的免疫系统，导致被感染的猪产生免疫抑制和其他病原微生物的继发感染[2,8-9]，因此，在仔猪水平上评价ACT对PCV2增殖的抑制效果，更能真实地反映ACT对PCV2感染引起的PCVAD是否具有防治效果。基于此，本研究在前期工作的基础上进一步通过体内试验评价ACT对人工感染PCV2仔猪体内病毒的复制及组织病理学影响。结果显示，两个剂量预先给药均能显著抑制PCV2攻毒后7、14、21 d仔猪外周血病毒载量；在攻毒后21 d将全部试验仔猪剖杀，发现ACT能抑制PCV2在腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体和肺组织中的增殖，且50 μg·kg-1给药组在腹股沟淋巴结和扁桃体内的病毒载量显著低于20 μg·kg-1给药组。

A、E、I、M、Q分别对应空白对照组的肺、脾、扁桃体、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结；B、F、J、N、R分别对应攻毒对照组的肺、脾、扁桃体、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结；C、G、K、O、S分别对应给药组1(20 μg·kg-1)的肺、脾、扁桃体、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结；D、H、L、P、T分别对应给药组2(50 μg·kg-1)的肺、脾、扁桃体、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结。B：粗箭头表示肺淤血，细箭头表示肺泡腔内的炎性细胞；F：箭头表示脾出血；J、N、R：圆形框表示淋巴小结的主要病变为水肿，淋巴细胞和网状细胞的变性坏死A, E, I, M, Q correspond to the lung, spleen,tonsilla, mesenteric lymph nodes, inguinal lymph nodes in control group; B, F, J, N correspond to above tissue infected by PCV2; C, G, K, O, S correspond to above tissue treated by ACT at 20 μg·kg-1; D, H, L, P, T correspond to above tissue treated by ACT at 50 μg·kg-1. B: The coarse arrows indicate lung congestion, the fine arrows indicate inflammatory cells; F: The arrow indicates splenic hemorrhage; J, N, R: The round boxes indicate edema, degeneration, necrosis of lymphocytes and histolytic cells图3 ACT给药后PCV2攻毒仔猪组织病理学变化(200×倍)Fig.3 Histological results inpigiet tissue of ACT deal with piglet infected by PCV2(200×)

A. 肺；B. 脾；C. 扁桃体；D. 肠系膜淋巴结；E. 腹股沟淋巴结A. Lung; B. Spleen; C. Tonsilla; D. Mesenteric lymph nodes; E. Inguinal lymph nodes图4 ACT给药后PCV2攻毒仔猪组织病理学评分Fig.4 Histopathological score in piglet tissue of ACT deal with piglet infected by PCV2

PCV2感染后引起猪的病理组织学病变主要表现在淋巴组织、肺、脾和扁桃体等。一般可见淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润并见多核巨细胞和上皮样细胞，淋巴窦扩张，其中充满单核细胞或其他的炎性细胞。有时也能观察到淋巴窦内多灶性的凝固性坏死[20-22]。本研究的组织病理学观察结果显示，攻毒组各组织均呈现以炎性细胞浸润为主的病理变化，这与Chae[22]的报道相似；而给药后，上述器官组织的病理变化不同程度减轻；同时，对ACT影响下PCV2感染仔猪的肺、脾、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结病理切片进行评分，发现20 μg·kg-1给药组在肺、脾组织的病理学评分显著低于攻毒对照组(P<0.05)；50 μg·kg-1给药组在肺、脾、扁桃体、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结5个组织的病理学评分均显著低于攻毒对照组(P<0.05)；两个剂量给药组在组织病理学评分上未显示显著差异(P>0.05)。组织病理学评分结果与仔猪扁桃体、肺、脾组织内的PCV2载量并不完全一致，考虑到荧光定量PCR方法检测的是PCV2核酸拷贝数，部分已失去活性的病毒仍被检出，计入病毒载量，提示我们分析评价药物作用时必须结合多角度结果进行综合分析。