超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化及其抗氧化活性探究

郭毓菲，张诗泉，王汉迪，李晓洁，曾百慧，胡 婷，向 福，吴 鹏*

（黄冈师范学院 生命科学学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈 438000）

茯苓（Poria cocos）又称茯灵，属多孔菌科。九资河茯苓闻名中外，是一种名贵的中药材，可安神、健脾，在治疗水肿、肾炎方面有显著功效。茯苓多糖主要存在于茯苓细胞壁中，具有促进细胞分裂、补体激活、增强免疫力、抗炎、消除自由基、抗氧化、抗衰老及抗肿瘤等作用[1-5]，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂，具有抗炎、抗肿瘤和增强免疫等作用。

茯苓多糖的提取方法[6]主要有稀碱浸提法[4]、超声波辅助酶法[7]、复合酶法[8]、发酵法[9]等，稀碱浸提法工艺流程复杂，操作较麻烦；发酵法耗时较长；复合酶-水浸提法必须严格控制变量。而超声波由于其独特的物理化学效应，近年来被广泛运用于部分中药材的多糖提取。该方法操作简单方便、耗时短、提取率高。但目前茯苓多糖的提取无法达到工业化。

中药多糖类物质抗氧化作用研究报道较多[10-11]，羧甲基茯苓多糖抗氧化作用已见文献报道[12]。本研究采用超声波法提取茯苓多糖，并对其提取工艺条件进行优化。同时通过测定茯苓多糖的总抗氧化力、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率，对其抗氧化活性进行研究，以期为茯苓多糖的开发利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

九资河茯苓：市售。

苯酚重蒸馏试剂（纯度80%）、浓硫酸（纯度95.5%）、维生素C（vitaminC，VC）、氯化铁、三氯乙酸、铁氰化钾、DPPH、葡萄糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；scientz-IIDM微波光波超声波萃取仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；732型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市顺华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖的提取

采用超声波法提取茯苓多糖[4-5]。挑选成色较好的茯苓块于（48±2）℃条件下恒温干燥48h，打磨成粉状，过筛80目，取样品1 g与水按一定料液比溶解，放入超声波萃取仪中于20℃条件下提取茯苓多糖（超声波间歇时间为3 s），经超声波提取后于3000r/min条件下离心20 min，离心后取上清液进行抽滤，抽滤液备用。

1.3.2 茯苓多糖的测定

采用苯酚-硫酸法测定茯苓多糖含量[13-14]。

葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取标准葡萄糖10 mg于250 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分别吸取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL于小烧杯中，用蒸馏水补至2.0 mL，然后分别加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL浓硫酸，摇匀冷却，置沸水浴显色15 min后室温冷却，采用分光光度计测定波长490 nm处的吸光度值。用2.0mL蒸馏水作为空白对照，制得葡萄糖标准曲线为y=0.010 8x+0.004 2，R2=0.999，线性关系良好，说明可用于茯苓多糖得率的测定。

样品中茯苓多糖含量的测定：取2 mL待测样品，添加1.0 mL 6%的苯酚溶液，再加入5.0 mL浓硫酸，置沸水浴显色15min后室温冷却，测定其在波长490nm处的吸光度值。

根据葡萄糖标准曲线计算得出茯苓多糖的提取量，进而得出茯苓多糖的得率，其计算公式如下：

式中：w为茯苓总多糖得率，%；c为样品液中葡萄糖质量浓度，μg/mL；d为稀释倍数；v为提取液总体积，mL；m为所称样品质量，g。

1.3.3 超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化单因素试验

超声波功率对茯苓多糖得率的影响：准确称取处理好的样品5份各1.0 g，按料液比1∶40（g∶mL）加入蒸馏水中，调节超声波功率分别为150 W、175 W、200 W、225 W、250 W进行超声波提取，超声时间为15 min，考察不同超声波功率对茯苓多糖得率的影响。每组试验重复3次。

料液比对茯苓多糖得率的影响：准确称取处理好的样品5份各1.0 g，调节料液比分别为1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL）加入蒸馏水中，在超声波功率200 W条件下进行超声波提取，超声时间为15 min，考察不同料液比对茯苓多糖得率的影响。每组试验重复3次。

超声时间对茯苓多糖得率的影响：准确称取处理好的样品5份各1.0 g，按料液比为1∶40（g∶mL）加入蒸馏水中，在超声波功率200W条件下进行超声波提取，调节超声时间为5 min、10 min、15min、20min、25min，考察不同超声时间对茯苓多糖得率的影响。每组试验重复3次。

1.3.4 超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化响应面试验[16]

响应面分析法将多因素试验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合，依此对函数的响应面和等高线进行分析，进而研究因素与响应面之间、因素与因素之间的相互关系[15，17-18]。根据单因素试验结果，以茯苓多糖得率（Y）为响应值，选择超声波功率（A）、料液比（B）、超声时间（C）为影响因素设计响应面试验[19]，响应面试验的因素与水平见表1。

表1 茯苓多糖提取工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

1.3.5 茯苓多糖抗氧化活性探究

抗氧化能力[20]：取30支试管，依次加入0.2mol/L、pH=6.6的磷酸钠缓冲溶液和1%铁氰化钾溶液各2.0 mL，分别加入不同质量浓度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0 mg/mL）的样品溶液和VC溶液2.0 mL，50℃恒温水浴保温20 min，取出后加入2.0 mL 10%三氯乙酸，振荡摇匀，3 000 r/min离心15 min。吸取2.0 mL上清液于试管中，加入2.0 mL蒸馏水，再加入0.5 mL 0.1%氯化铁，混合均匀后，于室温条件下反应10 min，在波长700 nm处测定吸光度值，每个质量浓度作3组平行试验。吸光度值越高，说明还原力越高。

DPPH自由基清除率：分别取不同质量浓度（1.0mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL）的样品溶液和相同质量浓度的VC2.0mL于试管中，加入2.0mL2×10-4mol/L的DPPH溶液，混合均匀，避光反应30min，在波长513 nm处测定其吸光度值A1，同时测定不加样品溶液的空白样的吸光度值A0，每个质量浓度作3组平行试验。对DPPH自由基的清除率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化单因素试验

2.1.1 超声波功率对茯苓多糖得率的影响

超声波功率对茯苓多糖得率的影响结果见图1。

图1 超声波功率对茯苓多糖得率的影响。Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of pachyman

由图1可以看出，超声波功率对茯苓多糖得率的影响很大。当超声功率在150～200 W范围内，茯苓多糖得率随着超声波功率的升高而增加；当超声波功率为200 W时，茯苓多糖得率达到最大，为1.74%；当超声波功率＞200 W之后，茯苓多糖得率随着超声波功率的升高而下降，分析原因可能是超声波功率过高，破坏了多糖的结构[17]，导致多糖得率降低。因此，超声功率200 W为宜。

2.1.2 料液比对茯苓多糖得率的影响。

料液比对茯苓多糖得率的影响结果见图2。

图2 料液比对茯苓多糖得率的影响Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the yield of pachyman

由图2可以看出，料液比影响茯苓多糖的得率。当料液比在1∶30～1∶35（g∶mL）时，茯苓多糖得率随着料液比的变化而增加；当料液比为1∶35（g∶mL）时，茯苓多糖得率达到最大，为1.62%；当料液比在1∶35～1∶50（g∶mL）时，茯苓多糖得率随着料液比的变化而下降，分析原因可能是茯苓粉含量减小，提取出的多糖浓度减小。因此，料液比1∶35（g∶mL）为宜。

2.1.3 超声时间对茯苓多糖得率的影响

超声时间对茯苓多糖得率的影响结果见图3。

图3 超声时间对茯苓多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of pachyman

由图3可以看出，超声时间对茯苓多糖得率影响显著。当超声时间在5～25 min范围内时，茯苓多糖得率随着超声功率的升高而减小；当超声时间为10 min时，茯苓多糖得率达到最大，为2.08%；当超声时间在10～30 min时，茯苓多糖得率随着超声时间的升高而下降；当超声时间＞15 min之后，超声时间对茯苓多糖得率影响较小，因为超声时间过长，影响了多糖的分子链，对多糖结构造成了破坏[21]，致使得率降低。因此，超声时间10min为宜。

2.2 超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化响应面试验

2.2.1 响应面试验结果分析

在单因素试验的基础上，以茯苓多糖得率（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计对茯苓多糖得率影响显著的3个因素超声波功率（A）、料液比（B）、超声时间（C）进行3因素3水平的响应面试验分析，结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表2 茯苓多糖提取工艺优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface experiments for extraction technology optimization of pachyman

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert软件对表2中的数据进行多元回归拟合[7，16]，得出茯苓多糖得率对超声波功率（A）、料液比（B）及超声时间（C）的二次多项回归方程：

Y=-10.068 25+0.045 20A+3.955 00B+0.148 20C-9.600 00AB-7.200 00AC-1.940 00BC-1.056 00A2-3.920 00B2-3.000 00C2

由表3可知，该模型的P=0.007 1＜0.01，极显著；失拟项P=0.798 1＞0.05，不显著，表明该方程合理可靠。一次项A、B、C和交互项AB、AC、BC对结果影响不显著（P＞0.05），二次项B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），A2对结果影响显著（P＜0.05）。3个因素对茯苓多糖得率的影响主次顺序为C＞A＞B，即超声时间＞超声波功率＞料液比。

由响应面分析法求得超声波提取茯苓多糖的最佳工艺条件为超声波功率194.52 W、料液比1∶34.31（g∶mL）、超声时间11.27 min，理论茯苓多糖得率为2.096%，考虑在实际操作上的方便性，将各因素修正为超声波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超声时间11 min。

2.2.2 验证试验

在最优工艺条件下进行验证试验，通过3次平行试验，得出实际茯苓多糖得率为（2.084±0.012）%，与回归方程预测值2.096%基本吻合，所以该模型有效。

2.2.3 交互项对茯苓多糖得率的影响

超声波功率、料液比及超声时间的交互作用对茯苓多糖得率影响的响应面及等高线见图4。

图4 超声波功率、料液比及超声时间的交互作用对茯苓多糖得率影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ultrasonic power,solid to liquid ratio and ultrasonic time on the yield of pachyman

由图4可知，超声波功率和料液比、料液比和超声时间、超声波功率和超声时间对茯苓多糖得率的影响均不显著（P＞0.05）。

2.3 茯苓多糖抗氧化活性测定结果

2.3.1 总抗氧化能力测定结果

茯苓多糖及VC的总抗氧化能力测定结果见图5。

由图5可知，当茯苓多糖质量浓度在1.0～3.0 mg/mL范围内，茯苓多糖的总抗氧化能力随茯苓多糖质量浓度的增大而增大。当茯苓多糖质量浓度为3.0 mg/mL时，总抗氧化能力最高，即吸光度值最大，为0.219。与阳性对照品VC比较，茯苓多糖样品的总抗氧化能力＜VC。

图5 茯苓多糖的总抗氧化能力测定结果Fig.5 Determination results of total antioxidant capacity of pachyman

2.3.2 DPPH自由基清除能力测定结果

茯苓多糖及VC对DPPH自由基的清除率测定结果见图6。

图6 茯苓多糖DPPH自由基清除率测定结果Fig.6 Determination results of DPPH free radical scavenging rate of pachyman

由图6可知，当茯苓多糖质量浓度在1.0～3.0 mg/mL范围内，茯苓多糖对DPPH自由基的清除能力并不明显，且均＜20%。当茯苓多糖质量浓度为2.5 mg/mL时，茯苓多糖对DPPH自由基的清除率最大，达到13%。与阳性对照品VC比较，茯苓多糖的DPPH自由基清除率均＜VC。

3 结论

本研究以茯苓多糖得率为响应值，利用响应面法对超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺进行优化，得出最优工艺条件：超声波功率200 W、料液比1∶34（g∶mL）、超声时间11 min。在此最优提取条件下，茯苓多糖得率为2.08%。通过对茯苓多糖抗氧化活性的研究得出，当茯苓多糖质量浓度为3.0 mg/mL时，总抗氧化能力最高，为0.22；当茯苓多糖质量浓度为2.5 mg/mL时，茯苓多糖对DPPH自由基的清除率最大，为13%，但均低于阳性对照VC。