新疆酿酒葡萄表皮乳酸菌的分离鉴定及耐受性分析

姜 蕾，周雪燕，王 斌，肖 婧，程卫东，史学伟*

（1.石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000；2.石河子大学 信息科学与技术学院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒酿造是由多种微生物共同参与的代谢过程，在没有人工外源接种的情况下，一般可以认为其表皮微生物源自酿酒葡萄本身[1]。葡萄酒中的细菌主要是乳酸菌[2]，目前乳酸菌主要分为明串珠菌属（Leuconostoc）、酒球菌属（Oenococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）[3]四大类。其对葡萄酒最重要的作用是进行苹果酸-乳酸发酵，苹果酸-乳酸发酵可使葡萄酒的酸度下降、口味柔和[4]。苹果酸-乳酸发酵主要由乳酸菌启动并执行，在苹果酸-乳酸发酵过程中，葡萄酒中的L-苹果酸经脱羧反应转化成乳酸和二氧化碳，从而降低葡萄酒的酸度，提高葡萄酒的感官特性和微生物的稳定性[5]。常见的乳酸菌分离方法主要有MRS培养基直接分离法[6]、富集法[7]和超膜过滤法[8]。

有研究表明，pH、酒精浓度、SO2等是影响葡萄酒中乳酸菌作用的主要因素[2，9]。吴正坤等[10]采用高通量测序从大曲中分离得到18株乳酸菌，耐受性分析结果表明菌株耐受8%乙醇和pH 3.5。因此，本试验通过对酿酒葡萄表皮乳酸菌的分离、鉴定、耐受性分析，筛选出适合新疆葡萄品质发酵的乳酸菌，从而启动并控制葡萄酒中的苹果酸-乳酸发酵，提升新疆本土葡萄酒质量，为制作新疆特色葡萄酒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

赤霞珠（CXZ）、美乐（ML）、霞多丽（XDL）、黑比诺（HBN）、贵人香（GRX）：新疆玛纳斯酿酒葡萄栽培区，5个品种的葡萄样品10例。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、酵母浸粉、琼脂粉、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、氯化氢、柠檬酸钠、氯化钠（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；Easy Pure Bacteria Genomic脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）试剂盒：北京全式金生物技术有限公司；EasyTaqSuper mix、DNA Marker、Gold view：北京博奥拓达科技有限公司。

1.1.3 培养基

筛选培养基（MRS培养基）[11]：葡萄糖2%，乙酸钠0.5%，蛋白胨1%，磷酸氢二钾0.2%，酵母膏0.5%，柠檬酸氢二铵0.2%，硫酸锰0.000 5%，硫酸镁0.02%，吐温80 1 mL，琼脂2%（固体培养基添加），蒸馏水配制，pH 6.2～6.6，121℃高压灭菌20 min。

菌株耐受性试验所用培养基均在MRS培养基的基础上进行改良[12]。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH，115℃高压灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；TC-512聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：英国Techne公司；Power Pac Universal电泳仪、Gel DOC XR凝胶成像系统：美国BioRad公司；CX21FS1光学显微镜：日本Olympus公司；LAC-5040S全自动高压灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；722光栅紫外分光光度计、标准型pH计：上海精密科学仪器有限公司；Bnp-9272智能生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将无菌操作采集的葡萄样品浸泡在无菌生理盐水中，28℃、170 r/min条件下培养0.5 h。

1.3.2 菌种的分离纯化

样品预处理液经梯度稀释，选取10-2、10-3、10-4、10-5浓度梯度进行涂布，每种梯度中吸取100 μL菌液于MRS固体培养基上，涂布均匀，每个样品涂布3个平板。28℃条件下倒置培养48h。选取平板中菌落特征（菌落直径、形态和颜色等）不同的单菌落，在MRS固体培养基上分离、纯化2～3次，直至平板上无不同菌落特征菌株[13-14]。其中革兰氏染色阳性菌、接触酶试验阴性的菌株暂定为乳酸菌。

1.3.3 菌种的鉴定

形态学鉴定：参考《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[15]与《伯杰细菌鉴定手册》[16]对其形态特征进行判断。

分子生物学鉴定：采用EasyPureBacteriaGenomicDNA试剂盒提取乳酸菌的DNA，以其为模板进行PCR扩增[17-19]。上游引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物为1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR扩增体系为模板DNA 2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，EasyTaqSupermix 25 μL，双蒸水（ddH2O）19 μL。PCR扩增程序[20]为95℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30次；再延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳[21]检测。

将电泳检测合格的PCR扩增产物送至上海生工生物有限公司进行测序。测序完成后将测序基因进行拼接，然后使用美国国立生物信息技术中心（national center for biotech nology information，NCBI）数据库中的BLAST工具进行同源性比对，获得同源性较高的菌株，使用ClustalW程序将菌株序列进行比对分析，然后采用软件Mega 6.0中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树[22]。

1.3.4 乳酸菌株的耐受性分析

菌株活化：取200μL保藏的菌株接种于10mLYEPD液体培养基中，在28℃条件下培养48 h。

pH耐受性试验：取活化完成并进入稳定对数期的菌液按4%（V/V）的接种量分别接种于pH值为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的MRS液体培养基中，30℃条件下培养48 h，每组设置3个平行，利用比浊法[23]每隔6 h测定一次培养菌液的OD600nm值，收集数据并绘制供试菌株的生长曲线。

耐盐性试验：取培养至稳定对数期的菌液，按照4%的接种量分别接种于氯化钠含量为0、6%、7%、8%、9%、10%的MRS液体培养基中，30℃条件下培养48 h，每组设置3个平行，每隔6 h测定一次培养菌液的OD600nm值，收集数据并绘制供试菌株的生长曲线。

乙醇耐受性试验：将培养至稳定对数期的菌液按照4%的接种量分别接种于无水乙醇体积分数为0、9%、10%、11%、12%、13%的MRS液体培养基中，30℃条件下培养48h，每组设置3个平行，每隔6 h测定一次培养菌液的OD600nm值，收集数据并绘制供试菌株的生长曲线。

SO2耐受性试验：取培养至稳定对数期的菌液按照4%的接种量接种于SO2质量浓度分别为0、50 mg/L、60 mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90 mg/L的MRS液体培养基中，30℃条件下培养48 h，每组设置3个平行，每隔6 h测定一次培养菌液的OD600nm值，收集数据并绘制供试菌株的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离

从10个葡萄样品中初步筛选得到37株乳酸菌，分别编号为axb65-axb102，并对筛选的菌种在MRS固体培养基表面的形态特征进行判断，初步分为4类（I、II、III、IV），分离菌株的菌落形态与细胞形态见图1、表1。

由图1和表1可知，菌株在MRS培养基中生长状况良好，单菌落呈乳白色，奶油状，中间有凸起，边缘整齐且光滑。通过革兰氏染色显微观察，菌株均为革兰氏阳性菌，杆状，个体微小，无鞭毛与芽孢，符合乳酸菌基本特征。

图1 各类型代表菌株在MRS培养基上的菌落与细胞形态Fig.1 Colony and cell morphology of each type of representative strains on MRS media

表1 MRS培养基上乳酸菌的形态特征Table 1 Morphological characteristics of lactic acid bacteria on MRS media

2.2 分子生物学鉴定

2.2.1 16S rDNA PCR扩增产物电泳检测结果

选取4种表型中生长较好的菌株各1株，分别为菌株axb74、axb79、axb80、axb81，提取其DNA并进行PCR扩增，PCR扩增产物电泳检测结果如图2所示。

图2 乳酸菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products from lactic acid bacteria

由图2可知，在1500bp左右出现了特异性扩增条带，且条带较为明亮，PCR扩增产物符合测序标准。

2.2.2 乳酸菌株的系统发育分析

基于菌株axb74、axb79、axb80、axb81的16S rDNA序列分析构建系统发育树，结果见图3。由图3可知，菌株axb81、axb79、axb80与柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）聚于一支，菌株axb74与乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）聚于一支。结合形态观察结果，将菌株axb79、axb80、axb81确定为柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum），菌株axb74为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis）。所以选取具有代表性的菌株axb74和axb79进行耐受性分析。

图3 基于16S rDNA基因序列分析乳酸菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences analysis

2.3 乳酸菌的耐受性分析

2.3.1 乳酸菌的pH耐受性分析

图4 乳酸菌axb74（A）与axb79（B）的pH耐受性测定结果Fig.4 Determination results of pH tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

由图4可知，随着pH值的降低，菌株axb74与axb79的生长受到了不同程度的抑制。在pH值为2.5的极酸环境下，两株菌的生长均受到了强烈抑制；菌株axb79在pH值为3.0的环境中OD600nm值为0.16，生长速率缓慢；菌株axb74在pH为3.5的环境中OD600nm值为0.18，菌株正常生长，而在pH＜3.0的环境中生长速率无明显提高。因此菌株axb74、axb79最高耐受的pH值分别为3.5、3.0。

2.3.2 乳酸菌的乙醇耐受性分析

由图5可知，随着乙醇含量的上升，菌株axb74与axb79的生长速率逐渐降低。当乙醇含量为12%时，菌株axb74的OD600nm值为0.14，生长速率缓慢上升；当乙醇含量增加至13%时，OD600nm值始终保持在0.04左右，生长速率无明显增加。当乙醇含量为11%时，菌株axb79的OD600nm值为0.13，生长速率缓慢增加；但当乙醇含量为12%、13%时，菌株axb79的OD600nm值均为0.035，生长速率无明显上升。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受乙醇含量分别为12%、11%。

图5 乳酸菌axb74（A）与axb79（B）的乙醇耐受性测定结果Fig.5 Determination results of ethanol tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

2.3.3 乳酸菌盐耐受性分析

由图6可知，随着NaCl含量的增加，菌株axb74与axb79的生长受到了不同程度的抑制。菌株axb74在NaCl含量为8%的环境中OD600nm值为0.18，生长速率缓慢上升，而在NaCl含量为9%、10%的环境中OD600nm值均为0.05。菌株axb79在NaCl含量为9%的环境中OD600nm值为0.19，延滞期延长至24 h，生长速率缓慢增加，而在NaCl含量为10%的环境中生长速率无明显提升，OD600nm值为0.03。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受NaCl含量分别为8%、9%。

图6 乳酸菌axb74（A）与axb79（B）的盐耐受性测定结果Fig.6 Determination results of salt tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

2.3.4 乳酸菌的SO2耐受性分析

图7 乳酸菌axb74（A）与axb79（B）的SO2耐受性测定结果Fig.7 Determination results of SO2tolerance of lactic acid bacteria axb74(A)and axb79(B)

由图7可知，菌株axb74与axb79的生长速率随着SO2质量浓度的增加而降低。菌株axb74、axb79在SO2质量浓度为80 mg/L的环境中生长速率均缓慢增加，但在SO2质量浓度为90 mg/L的环境中，菌株生长速率均无明显提升，OD600nm值始终保持在0.02左右。因此，菌株axb74、axb79的最高耐受SO2质量浓度均为80 mg/L。

3 结论

从新疆不同品种酿酒葡萄表皮中分离筛选得到37株乳酸菌，经形态观察将其初步分为4种类型，经分子生物学鉴定菌株axb79、axb80、axb81均为柠檬明串球菌（Leuconostoc citreum），菌株axb74为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）。

选取两类乳酸菌菌株axb74和axb79进行耐受性分析，结果表明，菌株axb74最高耐受12%乙醇、pH 3.5、80 mg/L SO2、8%NaCl，菌株axb79最高耐受11%乙醇、pH3.0、80mg/L SO2、9%NaCl。对后续制作新疆特色葡萄酒的菌种进行初步的确定，从而进一步为改进本土乳酸菌、提升酒品质量提供依据。