枸杞子药材中12种有机酸类成分含量测定与分析Δ

李佳兴，周 利，金 艳，余 意，马方励，杨 健，郭兰萍，2#

[1.中国中医科学院中药资源中心/道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；2.广东药科大学中药学院，广州 510006；3.无限极（中国）有限公司，广州 510663]

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、益精明目的功效，主要用于虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳痿遗精、内热消渴、血虚痿黄、目昏不明等症的治疗[1-2]。研究结果显示，枸杞子含有多糖、有机酸、黄酮、氨基酸、维生素和微量元素等[3-4]，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗肿瘤和调节免疫力等作用[5-8]。

有机酸类成分是中药中酸味的主要来源，中医五味讲“酸入肝”“酸收敛”，相关研究发现有机酸类成分具有抗炎、抗血栓、抑制血小板凝聚等多种药理活性[9-11]。据文献报道，枸杞子中含有草酸、酒石酸等多种有机酸[12]，但目前其相关含量测定研究较少见。本研究采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法对不同产地的枸杞子药材中水杨酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸、富马酸、3，4-二羟基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原儿茶酸等12种有机酸类成分的含量进行了测定，并进行了成分含量差异分析，以期为枸杞子的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

AB SCIEX 6500型质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；Acquity UPLC I-Class系统，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerTM色谱工作站（美国Waters公司）；SB-800DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MM型400混合球磨仪（德国Retsch公司）；DHG-9145AZ型电热干燥箱（上海恒科仪器有限公司）；New Classic MS-S型电子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；5810R型高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 试剂

咖啡酸对照品（批号：K003161216，纯度：≥98%）、对香豆酸对照品（批号：RD794160825，纯度：≥98%）、富马酸对照品（批号：F016170426，纯度：≥98%）、3，4-二羟基苯甲酸对照品（批号：RY568160920，纯度：≥98%）、酒石酸对照品（批号：J065161216，纯度：≥98%）均购自北京融诚鑫德科技发展有限公司；香草酸对照品（批号：S27M7115319，纯度：≥98%）、对羟基苯甲酸对照品（批号：MKBK3576V，纯度：≥98%）、阿魏酸对照品（批号：16051311，纯度：≥98%）、丁香酸对照品（批号：S23F7K9842，纯度：≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；原儿茶酸对照品（上海同田生物技术股份有限公司，批号：15050521，纯度：≥98%）；水杨酸对照品（批号：PS1136-0025，纯度：≥98%）、肉桂酸对照品（批号：PS0094-0100，纯度：≥98%）均购自成都普思生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

枸杞子药材采自宁夏、青海、甘肃、新疆等枸杞子主产区，共15批（见表1），经中国中医科学院中药资源中心金艳副研究员鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min，5%B→25%B；1～3.5 min，25%B→40%B；3.5～4.5 min，40%B→50%B）；流速：0.5 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1.0 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源：Turbo VTM离子源；电离模式：电喷雾离子化（ESI－）；气帘气体积流量：30 L/min；喷雾电压：－4 500 V；雾化气体积流量：50 L/min；加热辅助气体积流量：50 L/min；扫描方式：质谱多反应监测（MRM）；离子化温度：550℃。优化的条件参数见表2，提取离子流图见图1。

表1 枸杞子药材来源Tab 1 Sources of L.barbarum

表2 优化的条件参数Tab 2 Optimized conditional parameters

图1 提取离子流图Fig 1 Extraction ion flow graph

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取各待测成分对照品适量，用甲醇制成质量浓度均为1 mg/mL的单一对照品贮备液。分别精密量取上述单一对照品贮备液各适量，用甲醇分组制成含水杨酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸、富马酸质量浓度均为20 μg/mL的混合对照品溶液和含3，4-二羟基苯甲酸、酒石酸、丁香酸、原儿茶酸质量浓度均为20 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取药材样品细粉（过4号筛）50 mg，置于2 mL离心管中，精密加入甲醇1.5 mL，称定质量，超声（功率：250 W，频率：40 kHz，下同）处理30 min，放冷至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，12 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，用甲醇稀释制成系列单一对照品溶液。精密量取上述系列单一对照品溶液各1.0 μL，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号强度。以各待测成分的质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、离子信号强度（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程和线性范围见表3。

表3 回归方程、线性范围、定量限、检测限考察结果Tab 3 Results of regression equations，linear ranges，limit of quantity and limit of detection

2.4 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液各适量，用甲醇倍比稀释，并按“2.1”项下试验条件进样测定，分别以信噪比10∶1、3∶1计算定量限、检测限，结果见表3。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液各适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录离子信号强度。结果，水杨酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸、富马酸、3，4-二羟基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原儿茶酸离子信号强度的RSD分别为0.48%、0.74%、0.78%、0.96%、0.88%、0.61%、0.52%、0.64%、0.56%、0.95%、0.96%、0.60%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：11）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号强度。结果，水杨酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸、富马酸、3，4-二羟基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原儿茶酸离子信号强度的RSD分别为1.42%、0.81%、2.00%、1.43%、2.42%、1.36%、1.06%、1.97%、1.58%、1.68%、1.19%、2.31%（n＝5），表明供试品溶液在室温下放置8 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取药材样品（编号：11）细粉适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号强度并计算含量，结果见表4。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的药材样品（编号：11）细粉适量，每份0.1 g，共6份，分别加入一定质量浓度的单一对照品溶液各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号强度并计算加样回收率，结果见表5。

表4 重复性试验结果（n＝6）Tab 4Results of reproducibility tests（n＝6）

表5 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 5Results of recovery tests（n＝6）

续表5Continued tab 5

2.9 样品中有机酸类成分含量测定及分析

取各批药材样品适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，平行测定3次，记录离子信号强度并计算药材样品中有机酸类成分含量，然后进行成分含量差异分析和相关性分析，结果见表6～表9。由表6可知，15批药材样品中总有机酸平均含量为147.74 μg/g，其中以对香豆酸平均含量最高，达76.35 μg/g；阿魏酸、酒石酸和富马酸平均含量分别为19.25、16.50、15.74 μg/g；对羟基苯甲酸和肉桂酸平均含量较低，分别为8.13、4.90 μg/g；丁香酸平均含量最低，为0.17 μg/g。由表7可知，新疆产区所产药材样品中总有机酸平均含量最高，达209.21 μg/g；其次为青海产区样品，含量达154.31 μg/g；甘肃和宁夏产区样品含量较低。由表8可知，从品种看，宁杞七号总有机酸含量略高，达153.70 μg/g，其中对香豆酸平均含量为80.64 μg/g；宁杞五号总有机酸平均含量略低，为140.94 μg/g，其中对香豆酸平均含量为71.44 μg/g。由表9可知，香草酸含量与对羟基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）；肉桂酸含量与富马酸和酒石酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）；咖啡酸含量与阿魏酸、酒石酸和丁香酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）；对羟基苯甲酸含量与丁香酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）；阿魏酸含量与丁香酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）；3，4-二羟基苯甲酸含量与原儿茶酸含量存在极显著正相关（P＜0.01）。

3 讨论

本课题组采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法测定了枸杞子药材样品中12种有机酸类成分的含量，由试验结果可知，不同批次的枸杞子药材样品中总有机酸和12种有机酸类成分含量差异较大。推测其原因除了品种这一遗传因素外，不同产区的地理条件、土壤成分、气候特征、光照强度等生态因子也极大地影响了相关有机酸成分的积累[13-14]。

枸杞子药材样品中各有机酸类成分含量之间相关性分析显示，多种有机酸达到极显著正相关。中药的功效是多种成分共同作用的结果，与其不同成分的含量和比例相关，因此根据本研究结果中枸杞子药材中各有机酸类成分含量的相关性有助于进一步分析该类成分与复杂药效的关系。

表6 药材样品中有机酸类成分含量测定结果（n＝3，μg/g）Tab 6Content determination results of organic acids in samples（n＝3，μg/g）

表7 不同产区药材样品中有机酸类成分平均含量比较（μg/g）Tab 7Comparison of the average contents of organic acids in samples from different production areas（μg/g）

表8 不同品种药材样品中有机酸类成分平均含量比较（μg/g）Tab 8Comparison of the average contents of organic acids in samples with different types（μg/g）

表9 药材样品中各有机酸类成分含量之间的相关性Tab 9 Correlation of different organic acids in samples

综上所述，该方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性好，可用于同时测定枸杞子药材中12种有机酸类成分含量。不同产区、品种药材样品中有机酸类成分含量有所不同，且某些成分间有一定的相关性。