淫羊藿总黄酮提取物的HPLC指纹图谱建立及其中8种成分的含量测定Δ

牛晓静，鲁 静，孙广科，段晓颖，徐立然

（河南中医药大学第一附属医院，郑州 450008）

组分中药是指由有效组分配伍而成的现代中药，是创新中药研究的一种途径，其特点是“两个相对清楚”，即物质基础相对清楚及其作用机制相对清楚；组分中药具有满足现代药物质量可控要求，安全性、有效性证据较充分的特征，既保持了中药方剂的优势，又提高了中药制剂的质控水平[1-4]。本课题组对益元康方按照组分中药的研究思路开展基础研究，就该方组成药材之一淫羊藿中主要有效成分黄酮类成分进行提取、分离、纯化，得到淫羊藿总黄酮提取物。本研究中，本课题组采用高效液相色谱法（HPLC）建立了淫羊藿总黄酮提取物的指纹图谱，并对其中8种成分的含量进行了测定，旨在为有效控制其质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括四元泵、二极管阵列检测器、在线脱气装置、自动进样器、Openl AB色谱工作站（美国安捷伦公司）；CP225D型电子天平、BSA224S-CW型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 药品与试剂

淫羊藿总黄酮提取物（河南中医药大学第一附属医院中药制剂实验室自制，编号：G-1、G-2、G-3、G-4、G-5，总黄酮平均含量：71.6%）；淫羊藿苷对照品（批号：110737-200415，供含量测定用）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：111852-201102，供含量测定用）均由中国食品药品检定研究院提供；淫羊藿属苷A对照品（批号：151023，纯度：≥98%）、朝藿定A1对照品（批号：16071302，纯度：≥98%）、朝藿定A对照品（批号：130520，纯度：≥98%）、朝藿定B对照品（批号：130518，纯度：≥98%）、朝藿定C对照品（批号：130601，纯度：≥98%）、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ对照品（批号：151023，纯度：≥98%）均由成都普菲德生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclispse SB-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～8 min，15%A→20%A；8～25 min，20%A→23%A；25～40 min，23%A→30%A；40→50 min，30%A→32%A；50～68 min，32%A→35%A；68～75 min，35%A→45%A；75～80 min，45%A→60%A；80～85 min，60%A→15%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：270 nm；进样量：5µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 单一对照品贮备液 精密称取淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ对照品各适量，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释制成质量浓度分别为0.390、0.282、1.010、1.338、1.792、1.600、0.268、0.908 mg/mL的单一对照品贮备液。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密量取“2.2.1”项下单一对照品贮备液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得含淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ质量浓度分别为 19.50、28.20、50.50、66.90、89.60、160.00、26.80、27.24 µg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取样品20 mg，精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇20 mL振摇使溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：G-1）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以淫羊藿苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：G-1）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以淫羊藿苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于4%（n＝7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取样品（编号：G-1）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以淫羊藿苷峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，22个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度评价、共有峰相关分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成 取5批样品各适量，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）》对5批样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.4.2 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）》，以样品的HPLC对照指纹图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，5批样品的相似度均大于0.99，表明各批样品间差异较小，质量稳定性良好，详见表1。

2.4.3 共有峰的指认及相关分析 5批样品有22个共有峰，其峰面积合计占色谱峰总面积的90%以上。通过与对照品HPLC图谱比对，指认了8个共有峰分别为淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ。其中，20号峰为淫羊藿苷峰，由于其分离度较好、响应值较高，故以其为参照峰，计算其他峰相对于淫羊藿苷峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表2、表3。

图1 5批样品的HPLC叠加指纹图谱Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 5 batches of samples

图2 样品的HPLC对照指纹图谱Fig 2 HPLC control fingerprint of sample

表1 5批样品相似度评价结果Tab 1 Results of similarity evaluation for 5 batches of samples

2.5 含量测定

2.5.1 系统适用性 取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图3。由图3可知，8种成分峰分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000。

2.5.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表4。

表2 5批样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间Tab 2 Relative retention time of common peaks in HPLC chromatograms from 5 batches of samples

表3 5批样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积Tab 3 Relative peak areas of common peaks in HPLC chromatograms from 5 batches of samples

2.5.3 定量限与检测限考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以信噪比10∶1、3∶1分别计算定量限、检测限。结果，淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的定量限分别为390.00、564.00、506.00、535.20、448.00、426.68、643.20、544.80 ng/mL，检测限分别为97.50、141.00、126.25、133.80、112.00、106.67、160.80、136.20 ng/mL。

图3 高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms

表4 回归方程与线性范围Tab 4 Regression equation and linear range

2.5.4 精密度试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：G-5）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为1.15%、1.15%、0.15%、0.13%、0.08%、0.10%、0.33%、1.46%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.5.5 稳定性试验 取“2.2.3”项下供试品溶液（编号：G-5）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为1.31%、1.25%、0.15%、0.12%、0.08%、0.09%、0.31%、1.31%（n＝7），表明供试品溶液于室温下放置12 h内基本稳定。

2.5.6 重复性试验 取样品（编号：G-5）适量，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ的平均含量分别为2.94%、4.09%、4.76%、7.10%、17.33%、34.49%、0.89%、1.01%，RSD分别为2.04%、2.97%、2.93%、2.31%、2.16%、2.41%、1.61%、0.71%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.5.7 加样回收率试验 取已知含量的样品（编号：G-5）10 mg，共6份，分别加入“2.2.1”项下单一对照品贮备液（淫羊藿属苷A、朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ对照品贮备液分别加入750µL、1.5 mL、400µL、550µL、950µL、2 mL、330µL、110µL），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表5。

表5 加样回收率试验结果（n＝6)Tab 5Results of recovery tests（n＝6)

续表5Continued tab 5

2.5.8 样品含量测定 取5批样品各适量，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算其中8种成分的含量，结果见表6。

表6 样品含量测定结果（n＝3，%%）Tab 6 Results of content determination of samples（n＝3，%%）

3 讨论

本课题组前期通过均匀设计[5]，发现以60%乙醇提取淫羊藿总黄酮的效果最佳，由于淫羊藿总黄酮提取物中存在大量杂质，故通过大孔吸附树脂HPD-400进行纯化除杂后，可获得纯度较高的总黄酮，经测定其总黄酮平均含量为71.6%。

本试验参考文献[6-10]，采用HPLC法对5批已纯化的淫羊藿总黄酮提取物建立了指纹图谱，发现有22个共有峰，各批样品相似度均在0.99以上，质量稳定性良好。为进一步比较各批样品间的含量差异，选择标定指认的8个共有峰，建立含量测定方法。含量测定结果显示，5批样品中8种成分含量的RSD均小于5%，表明5批样品含量差异不大，提取及纯化工艺稳定、可行。

综上所述，所建HPLC指纹图谱可为淫羊藿总黄酮提取物的质量控制提供参考；所建含量测定方法简便、准确、重复性好，可用于同时测定淫羊藿总黄酮提取物中8种成分的含量。