牡丹皮药材的HPLC指纹图谱建立和聚类分析Δ

侯锡鸿，葛梅，张迎春，曾忠良

（西南大学药学院，重庆 400715）

牡丹皮为毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的干燥根皮[1]，其主要活性成分为以丹皮酚为主的酚酸类和以芍药苷为主的苷类[2]。牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀的功效，现代药理学研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等作用[3]，含有该药材的六味地黄丸是其临床应用的典范。

牡丹皮以重庆垫江产（习称“川丹”）、安徽铜陵和凤阳产（习称“凤丹”）的质量较优[4]，但因其基源植物牡丹集观赏性和药用于一体，在近年大力发展观光农业、大面积种植观赏牡丹的情况下，市售牡丹皮药材的产地及来源极其复杂、质量良莠不齐，其药用效果和临床用药安全也受到极大影响。2015年版《中国药典》（一部）牡丹皮的质量控制指标项下也仅有丹皮酚含量测定，显然难以全面反映该药材真实的内在质量。

指纹图谱技术能较全面地反映中药的特征化学信息，在样品真伪鉴别评价等方面表现出较大的优势[5]，且该技术与中医药整体观相符，目前已成为国际公认的中药及天然药物质量控制技术[6]。在目前牡丹皮基源植物育种背景不清楚、药材质量控制及评价体系不完善的大环境下，已有的相关检验鉴别技术专属性差等问题已显露[7-10]。为此，笔者对重庆垫江、安徽铜陵和亳州等地采集以及市售的共69批牡丹皮药材样品进行高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究，以期为该药材的真伪鉴别和质量评价提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AD型HPLC仪（包括DGU-20A3R脱气机、LC-20AD溶液输送单元、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、LC-Solution色谱工作站）、LCMS-8030型HPLC-质谱（MS）仪、AUW220D型十万分之一电子分析天平均购自日本Shimadzu公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（巩义市予华仪器有限责任公司）；CS-700型高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）。

1.2 试剂

丹皮酚对照品（批号：150722，纯度：＞98%）、芍药苷对照品（批号：150819，纯度：＞98%）、没食子酸对照品（批号：150729，纯度：＞98%）、没食子酸甲酯对照品（批号：150903，纯度：＞98%）均购自上海融禾医药科技发展有限公司；氧化芍药苷对照品（批号：YY90574-201703，纯度：＞98%）、苯甲酰氧化芍药苷对照品（批号：BWB51073-201704，纯度：＞98%）均购自中国食品药品检定研究院；丹皮酚原苷对照品（成都普思生物科技有限公司，批号：D-019-150925，纯度：＞99%）；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

69批牡丹皮药材样品由笔者自采或购买（来源见表1），经西南大学药学院陈前锋副教授鉴定为真品。

表1 牡丹皮药材来源Tab 1 Sources of P.suffruticosa

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Ecosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式检测；扫描范围：m/z100～1 200；干燥气：N2（纯度：99.999 9%）；干燥气流速：15 L/min；干燥气温度：350℃；碰撞低能量：4 V；碰撞高能量：10～40 V。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取丹皮酚、芍药苷、没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、苯甲酰氧化芍药苷对照品各适量，加甲醇分别制成单一对照品贮备液；分别精密量取上述单一对照品贮备液各0.8 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容摇匀，制成每1 mL含0.266 mg丹皮酚、0.798 mg芍药苷、0.884 mg没食子酸、1.393 mg氧化芍药苷、0.143 mg没食子酸甲酯、0.096 mg丹皮酚原苷、0.090 mg苯甲酰氧化芍药苷的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取药材样品适量，粉碎后过80目筛；取粉末0.5 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，精密加70%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率：700 W，频率：40 kHz）提取30 min；取出，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀；经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S19）适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，以丹皮酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，29个共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.37%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.54%～3.53%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S19）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、16、24 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，以丹皮酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，29个共有峰相对保留时间的RSD为0.01%～0.32%（n＝6），相对峰面积的RSD为0.47%～4.65%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 精密称取药材样品（编号：S19）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，以丹皮酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，29个共有峰相对保留时间的RSD为0～0.62%（n＝6），相对峰面积的RSD为1.47%～4.97%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC-MS指纹图谱分析

2.4.1 HPLC-MS指纹图谱的生成 取69批药材样品粉末各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对69批药材样品的HPLC图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

图1 69批药材样品的HPLC叠加指纹图谱Fig 1 HPLC superposed fingerprint of 69 batches of samples

图2 药材样品的HPLC对照指纹图谱Fig 2 HPLC reference fingerprint of samples

2.4.2 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，以生成的HPLC对照指纹图谱为对照，进行整体相似度评价。结果显示，69批药材样品中，除6批的相似度小于0.900外，其余63批的相似度均大于0.900，表明大部分药材样品间差异较小、质量稳定性较好，详见表3。

表3 69批药材样品相似度评价结果Tab 3 Similarity evaluation of 69 batches of samples

2.4.3 共有峰的指认及相关分析 根据MS离子峰及碎片信息与保留时间，综合对照品MS信息及文献报道的MS数据[11-14]对药材样品的指纹图谱中的共有峰进行结构归属的初步判断。通过与混合对照品MS图谱的离子峰信息进行比对，确定峰4、8、9、11、14、24、25分别是没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷、丹皮酚；推测鉴定出了29个共有峰，详见表4。

2.5 聚类分析

以各共有峰相对峰面积为变量，采用SPSS 20.0软件，以欧氏距离分层聚类法中的Ward法对69批药材样品进行系统聚类分析，详见图3。由图3可知，取欧氏距离为10时，69批药材样品可聚为5类：S4～S6为重庆垫江太平镇生长年限在17年及以上的药材样品，与其他药材样品有显著差异，相似度均小于0.800，和S41聚为第Ⅱ类；采自重庆垫江太平镇的S1～S3栽培品和采自安徽的S7～S9栽培品除S3外其他相似度均大于0.900，同S10、S12、S24、S25、S54、S59聚为第Ⅲ类；市售药材样品主要聚为第Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ类。

3 讨论

在预试验中，笔者比较了不同体积分数的甲醇（60%、70%、80%、90%）作为提取溶剂时的提取效率。结果，采用70%甲醇作为提取溶剂时，色谱峰数量较多，峰面积响应好，故选择70%甲醇作为提取溶剂。因丹皮酚为易挥发性物质，故提取方法选择超声提取。笔者考察了不同超声提取时间（15、30、45、60 min）对提取效率的影响，结果30 min的提取效率优于15 min，而再延长提取时间后提取效率无明显差别，因此选择30 min作为提取时间。

表4 药材样品HPLC对照指纹图谱中各共有峰对应成分的推测鉴定结果Tab 4 Speculativeness and identification of corresponding components of the peaks in HPLC reference fingerprint of samples

图3 聚类分析树状图Fig 3 Hierarchical cluster dendritic diagram

本试验通过对69批牡丹皮药材样品进行分析，并推测鉴定出29个共有峰的对应成分，主要是单萜苷类、酚酸类及黄酮类成分，这些共有成分可作为对牡丹皮药材进行质量控制的重要指标。

69批药材样品中有3批（S1～S3）为重庆垫江产的2年生的自采样品，3批（S4～S6）为重庆垫江产的17年以上的自采样品，3批（S7～S9）为安徽产的4年生的自采样品。相似度评价结果显示，生长年限在17年及以上的药材样品（S4～S6）的相似度均小于0.900，而其余市售或自采样品（除S21、S55外）相似度大部分均大于0.900，反映了生长年限在3～5年的药材样品质量更稳定。聚类分析中生长年限在17年及以上的药材样品（S4～S6）和S41聚为一类，显示出与其他药材样品有明显差异。重庆垫江另外3个自采样品（S1～S3）和安徽的自采样品（S7～S9）能聚为一类，显示两个产地品种质量的相似性。而市售其他药材样品主要聚为另外3类，且相似度大多大于0.900，提示市售药材样品化学成分整体上较为稳定，但也会受到产地、生长年限、加工方式、贮藏条件和时间等多种因素影响而产生一定波动[15-20]。

综上所述，本研究所建HPLC指纹图谱、成分鉴定和聚类分析结果可为牡丹皮药材的真伪鉴别和质量评价提供依据。