引发对老化大麦籽粒吸水量及活力的影响

2019-01-02，，，，，

种子 2018年12期

，，，，，

(石河子大学农学院，新疆石河子 832003)

种子在贮藏过程中会发生一系列生理生化方面的劣变，这种劣变导致其萌发率降低及幼苗的生长能力减弱甚至消失。种子引发不仅可以不同程度地提高种子的发芽特性，还可以修复种子的老化[1]。研究表明，不同类型的种子引发方式能够提高种子发芽率和出苗率[2-3]。

聚乙二醇具有无毒、粘度大、溶液通气性差，不通透过细胞壁等优点，可降低萌发过程中水分进入种子的速度，因而成为最常用的引发剂。目前，聚乙二醇引发已应用于小麦[4]、大豆[5]等植物老化种子的研究中。另外，Ca2+作为偶联胞外信号与细胞内生理生化反应的第二信使，是植物代谢和发育的主要调控者。用CaCl2溶液浸种能有效提高水稻幼苗的抗盐性，而且其光合速率、根系活力、叶绿素含量等均高于水浸种[6]。目前，用CaCl2浸种已广泛应用于桔梗[7]、黄秋葵[8]、烟草[9]、丹参[10]等的研究。总之，种子引发技术是目前国际上先进的种子处理技术之一，已广泛应用到玉米、水稻、小麦等多种粮食作物和芸薹属、胡萝卜、芽菜、黄瓜、茄子、洋葱、西瓜、番茄等蔬菜等作物上[11]。研究认为，引发具有促进种子萌发、提高出苗整齐度和增加活力的作用，但引发效果和引发条件的要求往往因植物种或品种甚至种批的不同而差异很大[12]。

目前关于大麦老化种子引发的研究少有报道。本试验采用人工加速老化法对大麦种子进行处理，比较不同引发方式对老化大麦籽粒吸胀曲线和活力的影响，筛选出最优引发试剂，为大麦种子贮藏和在生产实践中活力的保持提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以大麦品种甘啤4号和0416-1为实验材料，于2017年7月采自石河子大学实验站，保存于-20 ℃种子库。

1.2 种子人工老化处理

采用廖乐等[13]的高温高湿法，略作修改。挑选大小均匀一致的大麦籽粒，用0.1% HgCl2消毒5～10 min后冲洗干净，在40 ℃、相对湿度为80%条件下分别在培养箱中处理0，3.5，6.5，9.5 d，重复3次。用30 cm×40 cm白瓷盘盛满蒸馏水置于人工智能培养箱的顶层和底层，培养箱中间放3层架子并事先铺有尼龙网，将箱内温度调至40 ℃，平衡1 d，使培养箱内的温湿度稳定在40 ℃、80%相对湿度，然后将种子单层平铺于事先铺有尼龙网的培养箱的架子上进行老化(老化所用培养箱内部、白瓷盘、架子以及尼龙网等均需预先消毒)。处理完成后，取出种子在室温下风干，待其含水量降至原始水平即可进行相关实验。

1.3 种子引发

取上述老化处理后的种子适量分别放于烧杯中，加入事先配制好的20%PEG溶液浸泡，置于25 ℃恒温培养箱中浸泡24 h，取出后用蒸馏水冲洗干净，室温下回干备用，同时以蒸馏水浸泡的种子为对照。1%CaCl2溶液引发同上。

1.4 发芽特性指标的测定

1.4.1 发芽方法

根据国际种子检验协会标准发芽方法[14]，在20 ℃，相对湿度60%条件下，采用发芽盒纸上法，将经过老化、引发及未经过处理的大麦种子用蒸馏水冲洗3～4次，并用干净滤纸吸干种子表面浮水待用。在事先消毒好垫有3层滤纸(11 cm×16 cm)的发芽盒(16 cm×19 cm)中加入15 mL蒸馏水，将消毒好的大麦籽粒均匀摆放在滤纸上，每盒50粒，每处理重复3次，然后在20 ℃人工气候培养箱内培养，前3天暗培养，第4天起按照14 h/10 h的光暗比进行光照培养，每天统计种子发芽数，第7天统计结束。

1.4.2 测定内容

测定大麦种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数。

发芽势(%)=(第4天发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽率(%)=(第7天发芽种子数/供试种子总数)×100%;

发芽指数(GI)=∑Gt/Dt;

活力指数(VI)=GI×S。

式中:Dt为相应的发芽天数，Gt为与Dt相对应的不同时间(t)的发芽数，S为发芽7天幼苗的鲜重(g)。

1.5 吸胀曲线的测定

将老化0，3.5，6.5，9.5 d及用不同引发剂引发后的大麦种子按照测定发芽率的方法分别进行吸胀处理，每个处理3次重复，每隔6 h用无菌滤纸吸去种子表面的水，测定种子鲜重，并统计发芽数，连续测定72 h。以吸水量为纵坐标，吸胀时间为横坐标，绘制吸胀曲线。

1.6 相对电导率测定

种子浸出液相对电导率的测定采用电导率仪法[15]并作部分修改。每个大麦品种种子25粒，重复3次，先用去离子水冲洗3次，滤纸吸干种子表面残留水分。将种子放入200 mL烧杯中，加125 mL去离子水，用保鲜膜封住烧杯口在20 ℃光照培养箱中放置24 h，取出烧杯摇动使溶液均匀一致，测定浸泡液电导率d1，然后将烧杯置于100 ℃水浴锅中煮沸30 min，用电导率仪测定浸出液电导率d2。种子浸出液相对电导率(%)=(d1/d2)×100%。

1.7 MDA含量测定

MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法，用南京建成试剂盒进行测定。

1.8 数据处理与统计分析

试验数据利用Excel软件进行原始数据的处理，SPSS软件进行多重比较和相关性分析。多重比较采用Duncans法进行，结果以平均值(标准偏差)表示。

2 结果与分析

2.1 老化及引发后大麦籽粒吸胀曲线的变化

2.1.1 老化及引发后甘啤4号籽粒吸胀曲线的变化

由图1可知，未老化甘啤4号大麦籽粒在吸胀72 h内，随吸胀时间的延长籽粒吸水量呈快-慢-快的变化趋势，在最初6 h吸水量变化最大，6～30 h吸水量持续增加但幅度不大，30～72 h吸水量持续增加。老化6.5 d和老化9.5 d种子吸水量变化趋势基本相似但都小于对照和老化3.5 d。对照和老化3.5 d的大麦籽粒在30～72 h吸水量依旧迅速增加但始终对照吸水量最高，即随老化程度加深，种子吸水量越来越少，说明老化影响了种子的正常吸水。

图1 老化对大麦种子吸胀曲线的影响

由图2可以看出，甘啤4号大麦籽粒经20%PEG溶液引发后，种子吸水量均有增加的趋势且显著高于未引发时种子的吸水量，在最初6 h吸水量变化最大，与图1比较引发后30～72 h吸水持续增加且趋势显著，尤其对老化6.5 d和老化9.5 d的大麦籽粒效果最明显，而且PEG引发对中活力(老化6.5 d)的大麦籽粒吸水效果最显著，其吸水量一直处于最高水平。随吸胀时间持续增加至72 h，吸水量达到最大，并且引发后3种不同老化程度的大麦种子吸水量达到相同水平，说明20% PEG引发促进了种子的吸水。

图2 PEG引发对老化大麦种子吸胀曲线的影响

由图3可知，经1%CaCl2溶液引发后，大麦籽粒在最初6 h吸水量变化最大，与图1比较引发后30～72 h吸水持续增加且趋势显著，与图2中PEG引发相比较，CaCl2溶液引发对老化3.5 d的大麦籽粒效果最显著，其吸水量一直处于最高水平。对中活力(老化6.5 d)的大麦籽粒来说，显然CaCl2溶液引发要比PEG引发效果好。

图3 CaCl2引发对大麦种子吸胀曲线的影响

2.1.2 老化及引发后0416-1大麦籽粒吸胀曲线的变化

由图4可知，对大麦品种0416-1的籽粒在最初6 h吸水量变化最大，而后随吸胀时间的增加吸水量也在持续增加。对照和老化3.5 d籽粒的吸水量最高，其次为老化6.5 d，吸水量最低的为老化9.5 d的大麦籽粒，表明随籽粒老化程度加深其吸水量也在逐渐减小，说明老化影响了种子的正常吸水。

图4 老化大麦种子吸胀曲线的影响

由图5可知，0416-1大麦种子在最初6 h吸水量变化最大。与图4相比，经PEG引发后，种子吸水量有增加的趋势，尤其对中活力(老化6.5 d)的种子效果更显著，说明PEG引发促进了种子的吸水量。当吸胀时间达到72 h时，老化3.5 d和9.5 d的种子吸水量趋于相同。

由图6可知，0416-1大麦籽粒在最初6 h吸水量变化最大，经1%CaCl2溶液引发后籽粒吸水量有增加的趋势，尤其高活力(老化3.5 d)的大麦种子吸水量显著增加，6.5 d种子吸水量次之，9.5 d种子吸水量最低，由此可知，种子活力越高受损伤的程度越小，引发效果越好。

图5 PEG引发对老化大麦种子吸胀曲线的影响

图6 CaCl2引发对0416-1吸胀曲线的影响

2.2 引发对大麦老化种子发芽率的影响

随老化程度加深，2个大麦品种的发芽率均显著降低(表1)。老化6.5 d和9.5 d的甘啤4号大麦种子，经PEG引发后发芽率显著升高，尤其中活力(老化6.5 d)的大麦种子发芽率从71.33%升高至96.00%；同样经CaCl2引发后，对老化3.5 d和6.5 d的大麦籽粒发芽率显著升高，但低活力(老化9.5 d)的籽粒发芽率反而降低。对甘啤4号来说，PEG引发比CaCl2引发发芽率更高，效果更好。对0416-1来说，经PEG引发后发芽率较未引发显著升高，尤其对低活力(老化9.5 d)的大麦种子差异更显著；同样经CaCl2引发后，不同处理的发芽率都比未引发种子的发芽率高，对0416-1来说，CaCl2引发比PEG引发发芽率更高。

表1 引发对大麦老化种子发芽率的影响

品种老化天数(d)未引发20% PEG引发1% CaCl2引发甘啤4号097.33a(3.05)97.33a(3.05)97.33a(3.05)3.588.00bcd(4.00)93.33abc(5.77)95.33abc(5.03)6.571.33e(3.05)96.00ab(3.46)87.33cd(4.16)9.572.00e(2.00)92.00abc(3.46)70.00e(5.29)0416-1093.33abc(2.30)93.33abc(2.30)93.33abc(2.30)3.593.33abc(4.16)94.00abc(4.00)94.00abc(5.29)6.583.33d(3.05)96.00ab(3.46)94.67abc(4.16)9.561.33f(8.32)88.67bcd(1.15)90.67abcd(1.15)

注：不同字母表示在 0.05 水平不同老化天数和不同处理间差异显著，括号内数字为标准偏差。下同。

2.3 引发对大麦老化种子发芽势的影响

随老化程度加深，2种大麦品种发芽势均显著降低(表2)。对甘啤4号而言，经PEG引发后，老化6.5 d和9.5 d的大麦种子相比较未引发的发芽势显著升高，尤其对老化6.5 d的大麦种子其发芽势从68.67%迅速升高至94.00%；同样经CaCl2引发后，老化3.5 d和6.5 d的大麦籽粒发芽势显著升高，尤其对老化6.5 d的籽粒影响显著，但老化9.5 d的籽粒其发芽势反而降低。对甘啤4号来说，PEG引发比CaCl2引发其发芽势效果更好。对0416-1来说，经PEG引发后其发芽势较未引发显著升高，尤其对老化9.5 d的大麦种子其差异更显著；同样经CaCl2引发后，不同处理的发芽势都比未引发种子的发芽势高；同样对0416-1来说，PEG引发比CaCl2引发的发芽势更高。

表2 引发对大麦老化种子发芽势的影响

品种老化天数(d)未引发20% PEG引发1% CaCl2引发甘啤4号096.00a(3.46)96.00a(3.46)96.00a(3.46)3.586.67abc(4.16)90.67abc(8.32)95.33a(5.03)6.568.67d(1.15)94.00abc(2.00)83.33c(1.15)9.571.33d(1.15)90.67abc(4.16)64.67d(7.57)0416-1092.67abc(1.15)92.67abc(1.15)92.67abc(1.15)3.592.67abc(5.03)92.67abc(5.03)93.33abc(6.42)6.584.00bc(14.42)94.67ab(3.05)92.67abc(5.03)9.554.67e(8.08)89.33abc(1.15)85.33abc(3.05)

2.4 引发对大麦老化种子发芽指数的影响

随老化程度加深，2种大麦品种的发芽指数均显著降低(表3)。经PEG和CaCl2引发后，甘啤4号大麦种子发芽指数显著升高，尤其老化6.5 d的大麦种子，发芽指数分别从11.35%迅速升高至15.89%和14.89%，对甘啤4号来说，PEG引发比CaCl2引发的发芽指数更高一点。经PEG和CaCl2引发后，0416-1大麦种子发芽指数显著升高，老化9.5 d的大麦种子经不同引发后其发芽指数分别从9.5%迅速升高至15.35%和14.72%；同样，对0416-1来说，PEG引发比CaCl2引发的发芽指数更高。

表3 引发对大麦老化种子发芽指数的影响

品种老化天数(d)未引发20% PEG引发1% CaCl2引发甘啤4号017.07a(0.83)17.07a(0.83)17.07a(0.83)3.514.91bcd(0.94)15.74abcd(1.48)16.03abc(1.04)6.511.35e(0.81)15.89abcd(0.63)14.21cd(0.82)9.511.17e(0.50)15.59abcd(0.99)11.33e(1.32)0416-1016.73ab(1.15)16.73ab(1.15)16.73ab(1.15)3.516.01abc(1.12)16.77ab(1.26)16.11abc(1.39)6.513.89d(1.11)16.15abc(0.75)15.51abcd(1.10)9.59.50e(1.57)15.36abcd(0.92)14.72bcd(0.94)

2.5 引发对大麦老化种子活力指数的影响

由表4可知，随老化程度加深，甘啤4号活力指数先降低后升高，经PEG引发后活力指数随老化程度加深持续降低，但均比未引发时的活力指数要高，尤其对老化6.5 d的种子影响最大，其活力指数从4.88升高至7.03。同样经CaCl2引发后，活力指数先升高后降低，但均比相同程度下未引发时的活力指数要高。对于0416-1，随老化程度加深其活力指数先升高再降低，经PEG引发后活力指数随老化程度先升高后降低再升高，但均比未引发时要高，尤其对老化9.5 d的种子影响显著，其活力指数从4.65升高至7.26。同样经CaCl2引发后，其活力指数先升高后降低，但均比相同程度下未引发时的活力指数要高，尤其对老化9.5 d的种子影响显著，其活力指数从4.65升高至7.10。

表4 引发对大麦老化种子活力指数的影响

品种老化天数(d)未引发20% PEG引发1% CaCl2引发甘啤4号07.42abc(1.61)7.42abc(1.61)7.42abc(1.61)3.56.75bcd(0.23)7.16abc(0.91)7.53abc(0.31)6.54.88e(0.61)7.03abc(0.21)5.77de(0.40)9.55.06e(0.51)6.76bcd(0.46)5.12e(0.24)0416-107.53abc(0.33)7.53abc(0.33)7.53abc(0.33)3.58.03ab(0.51)8.08a(0.45)8.08a(0.58)6.56.30cd(0.11)7.06abc(0.62)7.16abc(0.64)9.54.65e(0.69)7.26abc(1.00)7.10abc(0.84)

2.6 引发对大麦老化种子相对电导率的影响

脂质过氧化产物丙二醛和相对电导率(REC)是衡量膜损伤程度的重要指标，相对电导率越大说明内含物外渗的速率越快、内含物外渗量增加，故而种子的损伤程度越高。由图7和图8可知，随老化时间延长种子电导率都呈快速升高的趋势，说明老化后其内含物外渗的速率增快、内含物外渗量逐渐增多，从而使浸出液相对电导率逐渐升高，也说明随老化程度加深种子受损伤程度也增加，待种子充分吸胀后，内含物外渗的速率放缓趋于稳定，电导率基本平衡。经PEG和CaCl2引发后电导率均逐渐减小，说明这2种引发溶液减小了与老化大麦种胚细胞之间的水势差，降低了水分进入种胚细胞的速度，从而使内含物外渗的速率放缓、内含物外渗量逐渐减少，故而推测引发缓解了种子的损伤。PEG引发对这2种老化种子的修复效果更好。

图7 引发对相对电导率的影响

图8 引发对相对电导率的影响

2.7 引发对大麦老化种子丙二醛含量的影响

丙二醛(MDA)是脂质过氧化产物，MDA含量升高，说明细胞膜系统受到损伤。MDA含量通常作为衡量活性氧对细胞造成伤害的一个重要指标[16]。由表5可知，对甘啤4号，随老化程度加深其丙二醛含量呈先降低后升高的趋势，即老化达到9.5 d时种子内部已发生一定程度的损伤。经PEG引发后其丙二醛含量呈先升高后降低的趋势，尤其老化9.5 d时与对照相比差异显著，从5.84 nmol/mg降至3.06 nmol/mg。同样经CaCl2引发后其丙二醛含量呈先升高后降低再升高的趋势。对0416-1，随老化程度加深其丙二醛含量呈先升高后降低的趋势，老化达6.5 d时其丙二醛含量最高，为6.42 nmol/mg。经PEG引发后其丙二醛含量呈先升高后降低的趋势，尤其老化6.5 d时与对照相比差异显著，从6.42 nmol/mg降至5.43 nmol/mg。同样经CaCl2引发后其丙二醛含量呈先升高后降低再升高的趋势，老化达9.5 d时其丙二醛含量最高，为4.87 nmol/mg。但总的来说，引发后其丙二醛含量均比对照要低，说明引发对老化损伤还是有一定的修复作用。

表5 引发对大麦老化种子MDA含量的影响

品种老化天数(d)未引发20% PEG引发1% CaCl2引发甘啤4号03.07abc(2.13)3.07abc(2.13)3.07abc(2.13)3.52.65bc(0.10)3.27abc(0.46)4.69abc(2.52)6.53.27abc(1.79)3.64abc(1.39)2.10c(0.65)9.55.84ab(1.41)3.06abc(1.93)3.95abc(1.57)0416-103.49abc(2.16)3.49abc(2.16)3.49abc(2.16)3.53.64abc(2.22)3.89abc(0.66)4.51abc(2.46)6.56.42ab(1.22)5.43abc(2.59)4.44abc(1.51)9.54.13abc(1.17)3.86abc(2.07)4.87abc(1.76)

2.8 大麦种子在老化和引发过程中部分生物学指标间的相关性分析

由表6可知，大麦种子在老化和引发过程中，发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数之间两两呈显著正相关关系，MDA与相对电导率呈负相关关系。而作为衡量膜损伤程度的重要指标，MDA和电导率与以上4个发芽特性指标之间均呈负相关关系。

表6 大麦种子在老化和引发过程中部分生物学指标间的相关性分析

品种指标GRGPGIVIMDA甘啤4号GP0.992**GI0.991**0.982**VI0.957**0.962**0.969**MAD-0.353-0.276-0.384-0.211REC-0.473-0.422-0.409-0.422-0.0950416-1GP0.987**GI0.974**0.979**VI0.911**0.910**0.956**MAD-0.057-0.032-0.157-0.307REC-0.274-0.293-0.316-0.243-0.156

注：**表示在0.01水平上相关(双侧)。GR表示发芽率；GP表示发芽势；GI表示发芽指数；VI表示活力指数；MDA表示丙二醛；REC表示相对电导率。

3 讨论

种子引发技术也称渗透调节，是一项控制种子缓慢吸水和逐步回干，从而提高种子发芽率的播前处理技术[17]。本研究表明，随老化程度加深，大麦种子内部发生了不同程度的劣变，主要表现在发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均显著降低，老化种子的电导率和MDA含量均显著升高，这与Nagel M等[18]的研究观点相同。经20%PEG和1%CaCl2渗透处理24 h后，2种大麦品种籽粒吸水量、发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数与对照比较均显著提高，经引发的大麦幼苗的长势显著优于未经处理的幼苗。引发后2种大麦品种老化种子的电导率和MDA含量均显著降低，这与王彦荣等[19]的研究结果相似。电导率可以反映植物受到逆境胁迫时的损伤程度，是反映细胞膜透性和完整性的一个综合指标，PEG引发使大豆种子保持了正常的膜透性和完整性，而使种子具有适应冷胁迫的能力，从而减轻了冷伤害的程度[20]。有研究表明，种子引发的实质是在限制种子吸水速率的条件下使种子膜系统得到较好修复并提前启动萌发所需的物质代谢，说明引发不仅能预防种子的吸胀损伤，还能缓解甚至修复其老化损伤。

聚乙二醇作为一种高分子渗透调节剂，其特殊的结构特征可减慢种子萌发初始吸水速度[21]，在萌发前使种子有足够的时间进行修复[22]，减少种子在低温吸胀时电解质和有机物的渗漏[23]；研究表明，PEG渗透调节处理显著提高葫芦种子的发芽势、发芽率和活力指数，降低种子外渗电导率[24]，种子老化会导致其细胞膜透性增大，膜完整性降低，从而造成种子活力下降；小麦种子用PEG引发处理后，电导率的降低证明了引发处理可以维持种子细胞膜的完整性，降低种子的电导率，修复种子的老化损伤，并显著提高其活力水平[25-28]。这与本研究结果相同。研究发现，PEG引发对老化种子的修复作用体现在两个方面：一方面，PEG引发提高了其超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化酶的活性，从而缓解老化过程的脂质过氧化损伤，表现为MDA含量减少[29-30]；另一方面，适当浓度的PEG引发可以启动种子细胞内的保护机制，降低其膜系统的损伤，增强膜系统的修复，从而提高种子萌发能力，促进幼胚的生长[31]。

除了大分子物质(如PEG)外，小分子物质(如CaCl2)也常用作引发剂，徐金金等研究表明，1% CaCl2引发后，2种不结球白菜的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数显著高于对照和其他处理[32]。这与本研究结果相同。CaCl2引发显著降低小麦种子发芽时间，幼苗的苗长度、幼苗的鲜重和干重显著升高，在出苗试验中，所有引发处理均不影响幼苗的出苗率、平均出苗时间和干重[33]。

高温高湿人工加速老化的大麦种子含水量普遍较高，与引发溶液之间的水势差较小，水分进入种胚细胞的速度也相对较慢，所以一般不会引起吸胀损伤。20% PEG和1%CaCl2溶液减小了引发溶液与老化大麦种胚细胞之间的水势差，降低了水分进入种胚细胞的速度。因此，适当渗透势的PEG和CaCl2溶液引发可以启动老化大麦种子体内的保护机制，降低种子吸胀过程中膜系统的损伤，增强膜系统的修复，从而提高大麦种子萌发能力。

目前，关于引发的研究最重要的课题是渗透调节的机制问题，而且关于引发的分子机理仍不清楚。随着生物技术的发展，从细胞和分子水平上探讨引发机理，寻找与引发效应相关的生理、生化、生物物理和分子标记，以作为控制种子吸湿活动和提高种子质量的工具，这一领域的研究有广阔的发展前景。本研究仅从生理生化的角度研究了不同引发的效应，对引发的分子机理还有待深入的研究。