Slit/Robo信号通路在肿瘤发生发展中的作用

梁刚，马清涌，王智翔，何盟国，郑康，谭栋，沈乃营

1陕西省核工业215医院普通外二科，陕西 咸阳 712000

2西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061

神经导向因子Slit家族是一类分泌型糖蛋白，可通过结合神经细胞膜上的Roundabout（Robo）受体家族发挥生物学功能。研究发现，Slit/Robo信号通路除了参与神经轴突导向作用外，还在脓毒血症时保护血管的完整[1]、白细胞趋化性反应、血管生成及损伤[2-4]、心血管系统的形成[5]、肿瘤的发生与发展[6-7]等方面发挥生物活性。本文就Slit/Robo信号通路与肿瘤发生、发展的关系作一综述。

1 Slit/Robo信号通路概述

Slit蛋白家族由Slit1、Slit2、Slit3组成，除在神经组织中表达外，在肿瘤细胞、白细胞、肺脏、肾脏、黄体等多种非神经组织中也有表达。Slit结构蛋白由1个N-末端信号肽、4个富含亮氨酸的重复序列（leucine-rich repeat，LRR，即D1-D4）、7～9个表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样的重复序列、1个半胱氨酸富有区C末端序列和1个层黏连蛋白G样结构域5个部分组成。其中，LRR是Slit蛋白与其受体Robo结合必需的区域。目前已有研究证实，Slit2蛋白水解后可产生1个N末端片段（Slit2-N）和1个C末端片段（Slit2-C）。Slit2-N端包含1个N-末端信号肽、4个LRR和5个EGF样的重复序列，分子量为140 kD；Slit2-C端则由剩下的部分组成，分子量为55～60 kD。

Robo家族是一类保守跨膜受体蛋白，由4个成员组成，包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，主要表达于神经系统，也可以表达于非神经系统，如血管内皮细胞、肌细胞等。Robo1、Robo2和Robo3由含有5个免疫球蛋白（Ig）结构域样功能区及3个Ⅲ型纤连蛋白（fibronectin typeⅢ，FN3）组件的胞外区、1个跨膜区和1个胞内区组成。胞内区域含有CC0、CC1、CC2、CC3四个小的区域。Robo4胞外区域只含2个Ig样功能区以及3个Ⅲ型纤连蛋白重复序列；胞内区域只含有CC0和CC2区域。Robo的胞内区域通过与细胞内某些活性物质结合，参与传导生物学信息。

在Slit/Robo信号通路中，配体和受体的稳定结合是通过Slit-N端的LRR尤其是Slit D2，与Robo胞外的Ig通过高度保守的静电作用及非亲水区域相结合。在硫酸类肝素（heparan sulfate，HS）蛋白多聚糖的参与下，Slit主要通过第2个LRR（D2）和Robo胞外前两个免疫球蛋白结构域样功能区（Ig1、Ig2）结合，激活Robo受体胞内区域，使其与下游效应物质如 Rho GTPases、Abl、Ena、ERK1/2、Vilse等相互作用，发挥复杂的生物学功能。需要指出的是，Robo1、Robo2、Robo3可以利用Ig1功能区与Slit2结合，而Robo4缺乏与Slit2结合的关键位点。

2 Slit/Robo信号在肿瘤中的表达

目前，Slit、Robo在多种肿瘤中均有表达，但其表达情况存在差异。在肿瘤表达升高方面，Wang等[8]研究发现，Slit2在鳞状胃癌、肝癌、恶性黑色素瘤、直肠黏液腺瘤等常见肿瘤中均有表达。Slit2在恶性黑色素瘤系A375细胞中表达上调，而Robo1则在肿瘤血管内皮细胞中表达，推测肿瘤细胞分泌蛋白Slit2与血管内皮细胞分泌的Robo1以旁分泌的方式参与恶性黑色素瘤的发生。在直肠癌肿瘤细胞中，Robo1的表达水平明显上调，而Robo4和Slit2的表达无明显变化，但Robo4基因的表达水平在肿瘤血管内皮细胞中明显上调，因此，Robo蛋白可能成为对抗肿瘤生成及肿瘤血管产生的潜在治疗靶点[9]。在乳腺癌中，Schmid等[10]检测出Robo1呈现高表达，Slit2能够诱导表达Robo1的肿瘤细胞发生脑转移。

在肿瘤表达下降方面，有研究显示，Slit、Robo基因在许多恶性肿瘤中表达下调。Slit可以通过结合其受体Robo调节多种由趋化因子诱导的体细胞的迁移，但是这些基因在人类的许多肿瘤中由于启动子的甲基化而灭活[11-13]。Narayan等[14]认为Slit、Robo基因的修饰变化在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用，Slit、Robo基因常常表现出高度频繁的启动子甲基化，而导致它们在侵袭性宫颈癌中的表达量减少。但是在宫颈癌细胞系中，用DNA甲基化抑制因子和组蛋白去乙酰化酶不能有效地再活化Slit、Robo基因。在鼠类的乳腺癌细胞中，Slit或其受体Robo缺失时常常伴随着SDF1和CXCR4的表达上调，还可出现周围间质细胞的病理性增生肥大和结缔组织的增生。在乳腺癌组织中，同样表现出Slit和CXCR4表达相反的情况。在异种移植动物模型中，Slit的过表达可以下调CXCR4，同时抑制肿瘤细胞的增殖。这些现象均表明Slit可以作为SDF1和CXCR4的负性调节因子，从而参与乳腺癌的进展过程[15]。

即使在同一个肿瘤中，Slit和Robo的表达也有差别。Avci等[16]采用基因检测的方法，发现Slit和Robo基因在肝细胞系及肝癌组织中表现出两种表达 模 式 ，一 种 是 Robo1、Robo2、Slit1；一 种 是Robo4、Slit2、Slit3。Robo1、Robo2表达明显上调，但Slit3在有高甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）时表达明显下降。与正常肝脏组织相比，Robo1在肿瘤组织中表达升高，而Robo4在肿瘤组织中表达下降。

Slit和Robo在上述组织中差异性的表达，说明了Slit/Robo信号通路具有复杂性，这与Slit/Robo信号通路不同配体、受体之间的相互作用以及机制的不同有关，需要进一步深入研究。

3 Slit/Robo信号对肿瘤新生血管的作用

肿瘤新生血管的形成对肿瘤的发生、发展及转移都具有很大的促进作用。目前已发现在血管内皮细胞中存在Robo1、Robo4两种受体，在Slit/Robo信号通路中，它们对血管内皮细胞的作用不同，进而影响新生血管的形成。

在促进肿瘤新生血管生成方面，Wang等[8]研究发现，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）存在着Robo1受体，肿瘤细胞分泌的Slit2可以与其结合，吸引HUVEC向肿瘤迁移，诱导肿瘤新生血管形成。但是，应用Robo1的细胞外片段或Robo1抗体对Slit2进行预处理后，HUVEC则无迁移现象。通过阻断Slit2/Robo1信号通路可以抑制仓鼠颊黏膜鳞状细胞癌动物模型中肿瘤新生血管的形成，因此，针对Slit/Robo的靶向治疗可成为口腔癌抗肿瘤新生血管生成治疗的一个新方向[17]。Slit2结合Robo1可以促进淋巴内皮细胞迁移和管样结构形成，其作用可被功能性抗体R5阻断，因此，Yang等[18]推测Slit2是一个有潜力的淋巴血管生长因子。

在抑制肿瘤新生血管形成方面，目前研究认为，Robo4是内皮细胞特异性基因，在人微血管内皮 细 胞（human microvascular endothelial cell，HMVEC）及HUVEC中均有表达，具有抑制内皮细胞迁移的功能。Seth等[19]在黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤血管内皮细胞中检测到Robo4的表达，并发现Robo4被Slit2激活后，可抑制由血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）诱导的细胞迁移作用，而这种抑制作用是通过Ras-Raf-Mek-Erk信号通路所介导的。Stella等[20]研究发现，Slit2/Robo1信号通路能够抑制运动因子诱导的内皮细胞迁移。通过siRNA灭活Slit2基因或使Robo基因异常表达，可以促进肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）诱导的内皮细胞迁移、侵袭和血管生成，并上调细胞分裂周期蛋白Cdc42的表达和降低Rac-1的活性。而当细胞Slit2蛋白主动分泌增强或外源性加入Slit2蛋白时，可以抑制HGF触发的细胞能动反应，降低Cdc42的活性，激活Rac-1。

Enomoto等[21]对Robo1、Robo4的研究发现，在Robo4基因敲除的情况下，Slit2可以诱导HUVEC迁移，而这种作用在Robo1缺失的情况下消失，说明了Slit2/Robo1可以诱导血管的生成，Slit2/Robo4则负性调节血管的生成。Sheldon等[22]通过免疫共沉淀测定发现Robo1、Robo4可形成异二聚体，通过协同作用调节HUVEC肌动蛋白细胞骨架，调控细胞迁移。笔者设想，Slit/Robo信号通路在肿瘤血管生成的过程中主要有Slit2/Robo1和Slit2/Robo4两个亚通路参与，前者诱导肿瘤血管生成，后者的作用相反，这两个亚通路在某一段时期会以其中一条亚通路的作用为主，与血管周围环境保持着动态平衡，进而维持血管的生成。另外，Zhang等[23]研究发现，Slit3分泌和表达于血管内皮细胞及平滑肌细胞，以旁分泌或自分泌形式通过结合Robo4刺激内皮细胞增殖，促进内皮细胞运动，从而调节血管内皮细胞迁移，因此，认为Slit3是一个新型的血管生长因子。

总之，Slit/Robo信号与肿瘤血管的作用及机制复杂，在不同的微环境下，Slit/Robo信号对血管生成及内皮细胞迁移的作用不尽相同，这个观念也逐渐成为大家的共识。尽管Slit/Robo信号与肿瘤血管之间的很多问题尚未解决，但是随着研究的深入，Slit/Robo信号通路很有可能成为抗肿瘤血管治疗的新靶点。

4 Slit/Robo信号对肿瘤细胞生长及迁移的作用

肿瘤细胞生长及迁移是原发性肿瘤发展为继发性肿瘤的一个必要条件，也是肿瘤患者死亡的主要原因。Slit/Robo信号对肿瘤细胞生长及迁移的作用报道不一，在抑制肿瘤细胞生长及迁移方面，有研究报道在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，添加重组的Slit2能够缩小肿瘤体积，应用Robo1-Fc阻断Slit2可使肿瘤生长，并使细胞形成更具侵犯性的形态[24]。Kong等[25]发现表达Slit的肺癌细胞的成瘤能力及侵袭能力均降低。他们认为，抑癌基因Slit通过结合Robo受体，进而使Robo受体胞内区域结合肌球蛋白9（Myo9b）的RhoGAP酶，并抑制RhoGAP酶活性，从而抑制GTP-RhoA向GDP-RhoA转化，导致GTP-RhoA增加，进而抑制细胞的迁移及侵袭。Slit-Robo Rho GTP酶激活蛋白1（Slit-Robo GTPase-activating protein 1，srGAP1）是Slit-Robo途径下游的关键GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），已有研究显示，通过减少活化的Cdc42能够抑制神经胶质瘤细胞的侵袭[26]。Feng等[27]发现SrGAP1在结肠癌细胞中的表达较癌旁组织下降47.5%，且与淋巴管浸润、肿瘤分化差、TNM分期高、生存期短有关。与Slit2结合后，Robo1胞质内结构域发生改变，并促使srGAP1募集到Robo1的胞内结构域，可通过减少活化的Cdc42，抑制结肠癌肿瘤细胞的迁移。在食管癌中，Slit2对Cdc42和细胞迁移的负调控作用也有报道[28]。Slit/Robo信号通路还可抑制口腔鳞状细胞癌的迁移[29]。

在促进肿瘤细胞生长及迁移方面，Zhao等[30]发现通过上调MMP-2、MMP-9及下调E-钙黏连蛋白，Slit2/Robo1信号通路可促进舌癌细胞的黏附、侵袭及转移。通过在小肠癌小鼠模型中研究发现，Slit2、Robo1在小肠癌中呈过表达，激活Slit2/Robo1信号通路可诱导小肠黏膜发生恶变，并通过活化Src信号下调E-钙黏连蛋白，进而激活Wnt/βcatenin 途径，促进肿瘤的发生、发展[31]。Li等[32]发现Robo1、Robo4表达于膀胱癌细胞中，阻断Robo4对种植瘤的存活及生长无影响，而阻断Robo1后，种植瘤的存活量及体积明显缩小。Schmid等[10]研究发现，CXCR4、Robo1、Slit2均可以在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中表达，CXCL12诱导的乳腺癌细胞迁移作用可以被Slit2抑制，但Slit2对表达Robo1的乳腺癌细胞具有诱导细胞迁移的作用，并且Slit/Robo信号通路可以上调MMP-9基因的表达，增强肿瘤细胞的侵袭性。

Slit/Robo信号通路在肿瘤细胞生长及迁移中的作用目前尚无定论，甚至矛盾，例如在结肠癌中，Slit2结合Robo1受体可以诱导结肠癌细胞的生长及转移[33]。而Chen等[34]认为Slit2可通过抑制AKT信号通路和上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）发挥抑制结直肠癌转移的作用。Huang等[35]认为Slit2/Robo1信号对结肠癌细胞的抑制迁移作用由泛素特异性蛋白酶33（ubiquitin specific protease 33，USP33）介导，并将USP33作为结肠癌的一个独立的预后指标。

各方面矛盾的研究结果说明了Slit/Robo信号通路对肿瘤生长及迁移作用的复杂性，这与Slit/Robo信号通路的多个受体、配体参与及其下游的多种机制调控有关，甚至在一些肿瘤中，肿瘤细胞周围的间叶组织也可参与到该信号通路中，对肿瘤的侵袭发挥作用[36]。因此，对Slit/Robo信号通路与肿瘤的关系进行研究时，不能孤立地仅看某一方面的作用，从多方面思考可能会加深对两者深层次关系的认识，从而为今后的研究提供更加广阔的视野。

5 小结与展望

综上所述，尽管Slit/Robo信号通路对肿瘤发生、发展的作用及机制尚未完全阐明，甚至现有的报道存在矛盾，但仍可看出其与肿瘤密切相关。综合目前已有的研究或报道，笔者大胆地推测，Slit/Robo信号通路对肿瘤的作用与Slit、Robo结合的受配体及肿瘤周围的微环境有关。不同的Slit、Robo如何结合，不同亚型的Slit/Robo信号通路对肿瘤的作用如何，对肿瘤的作用受哪些因素的影响，Slit/Robo信号通路下游机制是什么，这些复杂的问题均有待于进一步深入研究，从而为肿瘤的治疗提供新的理论依据。

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