Western blot在大鼠心肌缺血炎性因子研究中的应用*

余帮兴 梁文斌 王 文

(1. 首都医科大学宣武医院实验动物室，北京 100053)(2. 武汉市武东医院、武汉市第二精神病医院外科， 武汉 430084)

Western blot技术广泛应用于检测蛋白水平的表达[1-3]，该实验技术步骤繁琐。急性心肌梗死是一个严重威胁人类的高死亡率的疾病。炎症在急性心肌梗死损伤与修复中有着重要的作用[4]。本文探讨Western blot在大鼠心肌缺血炎性因子研究中的应用：

1 材料与方法

1.1 材料

研究用的抗体及化学试剂等：IL-6(abcam,ab9324)，TNF-α(abcam,ab11564)，IL-1β(abcam, ab9722)，GAPDH(CST,#5174)，NF-κB p65(abcam,ab19870)，NF-κB p65(CST8242)，二抗(中杉金桥ZB2301、ZB2305, ZSGB-BIO, 中国)，RIPA裂解液(强)(碧云天公司)等。

1.2 实验仪器

小动物呼吸机；多导生理信号记录仪； Bio-Rad电泳仪；化学发光凝胶成像系统等。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠,体质量250～280 g，北京维通利华公司购入，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.4 方法

1.4.1心肌缺血造模[5]:6-0带线缝合针结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD)，造模成功后3 d摘取大鼠心脏，转存于-80 ℃冰箱。

1.4.2样品制备:用眼科剪快速剪碎心脏左心室组织，按1∶6的比例加裂解液RIPA，再加1%PMSF(1 mL RIPA加10 μL PMSF)，静置半小时以上，先机械匀浆至没有明显的大颗粒，再超声粉碎至没有沉淀，所有步骤均需在冰上操作，以防止蛋白质变性。12 000 r/min 30 min离心取上清液转移至新的EP管中。离心机应提前预冷至4 ℃。

1.4.3定蛋白(BCA法): BCA定量法(参考普利莱公司BCA试剂盒说明书)，所有步骤均需在冰上操作。定蛋白过程如下：8个EP管分别标记1 600、800、400、200、100、50、25、0(尽量用小的EP管，这样误差小，标准曲线才可能更准确)，第一个EP管90 μL ddH2O，余下每个EP管均80 μL，然后第一个1 600 EP管加60 μL BSA标准品，以涡旋器上最大涡旋速度涡旋1 600 EP管并用移液器反复吹打，以保证蛋白在ddH2O中充分混匀，然后吸1 600 EP管中物80 μL入800EP管中，涡旋器上最大涡旋速度涡旋EP管并移液器反复吹打；吸800EP管中物80 μL入400EP管中，依此类推至25EP管，最后一个EP管仅含ddH2O。倍比稀释每步均需充分涡旋并用移液器反复吹打。样本按表1稀释。

表1 标准品BSA及样品稀释方法

注:之具体含义参见文中详细描述 Note:described in detail in this paper

工作液(WR)配制： 1 mL BCA Reagent+20 μL Cu Reagent为WR(多配点，保证够用)，呈绿色。

96孔板中每孔加25 μL稀释后的BSA及样本溶液，然后每孔按200 μL加工作液(WR)。96孔板摇床上37 ℃ 30 min。用酶标仪(波长562 nm)测A值(2个复孔)。

Microsoft Excel 软件上操作：散点图 → 标准曲线 →A平均值 → 蛋白浓度→ 样品体积μL(以最低蛋白浓度为准×100/蛋白浓度)→ 加裂解液体积μL(100-样品体积)。 加5×loading buffer 25 μL(即变成1×LB)，95 ℃ 10 min变性。举例如表2、图1、表3。

图1 标准品BSA标准曲线

表2 标准品BSA倍比稀释后A值结果

表3 100 μL变性前样品(原样品体积及应加入裂解液体积)

注：75.2=33030/439.1,81.3=33030/406.1333

1.4.4灌注凝胶和电泳

第一步：清洗玻璃板

第二步：配胶

①对齐玻璃板,垂直卡紧在Bio-Rad绿色架子上；

②根据目的蛋白的分子量配不同浓度的分离胶，在分离胶溶液中加入过硫酸铵(AP)、TEMED，立即快速摇动混合并迅速往两玻璃板的间隙中灌注溶液,至约平绿色架子横杆下缘处(梳子的齿长再加0.5 cm)。随后在分离胶上小心加一层双蒸水[6]。

③约20～30 min后，当双蒸水和胶之间有一条分界线时，倒去胶上覆盖的双蒸水并用滤纸吸净，注意两端的水要吸净。配浓缩胶，加入过硫酸铵(AP)、TEMED后立即摇匀迅速灌胶。灌满浓缩胶，然后将干净的梳子迅速插入浓缩胶中。灌胶及插梳子过程中要避免气泡产生。待到浓缩胶凝固(30～40 min)后，将玻璃板固定于电泳装置上(小玻璃板朝内，大玻璃板朝外)。先在电泳槽的内槽加满电泳液(1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液)，然后双手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将梳子拔出[6-7]。

第三步：上样

测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的样本体积即为上样量。Marker 上样量按说明书的推荐量，一般是3～5 μL。微量加样器吸取样品，上样后用双蒸水清洗微量加样器，无菌纱布擦净针头上的双蒸水。两端加等体积的1×Loading buffer，以压平电泳条带。

第四步：电泳

将电泳装置与电源相接，先恒压60 V，待浓缩成一条直线时改为恒压90 V(或110～130 V)，电泳至溴酚兰到达分离胶底部上方约1 cm处时关闭电源，从Bio-Rad电泳装置上卸下玻璃板，双蒸水冲洗玻璃板，撬开玻璃板，切去浓缩胶及多余的分离胶。 剥离剩余的分离胶，转移至1×转膜液中漂洗。

1.4.5转膜:跑胶时准备转膜用品。1×转膜液按1∶2∶7配方，即10×电转液100 mL十200 mL甲醇十700 mL双蒸水。转膜液提前置于冰中预冷(此步很重要)。提前将NC膜或PVDF膜、海绵、滤纸一起浸泡入1×转膜液中。

将夹子打开使白的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，在海绵垫上垫2层滤纸，NC膜凹面朝上放于滤纸上(此处要注意NC膜的方向性，否则蛋白质不能转移到NC膜上)，将分离胶覆盖于NC膜上，在胶上盖2层滤纸，用玻棒擀走里面的气泡，最后盖上另一个海绵垫，再次用玻棒擀走里面的气泡，合起夹子。整个操作在1×转膜液中进行。装有1×转膜液的器皿整个操作过程均置于冰上。

将夹子放入电转槽中，黑对黑，白对红。4板胶电转槽中1×转膜液1 000 mL左右。电转时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在电转槽中要放冰袋。电转槽的3/4部分整个转膜过程均置于冰水混合液体中。

1.4.6孵育抗体: ①转移膜1×丽春红中漂洗，蒸馏水中漂洗，剪下目的条带并作好标记，转至1×TBST液中，摇床上漂洗；②5%(w/v)脱脂奶粉封闭液室温摇床上封闭目的条带1 h；③5%(w/v)脱脂奶粉封闭液稀释一抗，一抗孵育，4 ℃冰箱过夜；④1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min；⑤5%(w/v)脱脂奶粉封闭液稀释二抗，二抗室温孵育2 h；⑥1×TBST漂洗，洗3次，每次10 min。

1.4.7ECL化学发光凝胶成像:暗室中，将A和B两种试剂在塑料管中1∶1体积混合，注意不能用同一枪头吸取A和B试剂，每个目的条带迅速加约200 μL ECL化学发光剂，按照化学发光凝胶成像系统操作说明书曝光，用凝胶图像处理系统(AlphaView SA软件)分析目的条带和内参条带的净光密度值。

2 结果

Western blot实验结果：大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表达增加(图2和表4),与假手术组比较，缺血模型组(72 h)炎性因子IL-6, TNF-α显著增加(P<0.001) , 结果表明IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性因子参与了大鼠心肌缺血的病理生理过程，炎症加重心肌缺血损伤。

表4 大鼠心肌缺血前、心肌缺血后72 h炎性因子表达水平

注：数据以Mean±SEM表示，model vs. sham，#p<0.05，###p<0.001，n=6 Note: Mean±SEM, model vs. sham,#p<0.05,###p<0.001,n=6

图2 大鼠心肌缺血72 h后炎性因子(IL-6 ,TNF-α, IL-1β)表达增加炎性因子参与大鼠心肌缺血的病理生理过程

3 讨论

Western blot为常用的检测蛋白质的方法，其操作步骤较多[8]，大鼠心肌缺血炎性因子Western blot操作应该注意以下问题：①开胸摘取的心脏迅速置于0.9%生理盐水中，离开大鼠的心脏在0.9%生理盐水中仍能跳动并搏出心腔内的血液，待大鼠心脏搏动减弱时迅速置于另一个0.9%生理盐水器皿中，直至生理盐水颜色变淡，以避免红细胞对A值的影响；②在冰袋上用眼科剪快速剪去左右心房、大血管及右心室大部分，将剩余的大鼠心脏组织一分为二(一份后续实验，一份备份)，吸水纸(或无菌小纱布块)将大鼠心脏组织水分吸干净，样本锡箔纸包裹(编号)存放于液氮罐中，待取材完毕转到-80 ℃冰箱存放；③加裂解液RIPA的比例问题：大鼠心肌炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB)丰度低，Western blot预实验发现按1∶6～7的比例较好，若按1∶5的比例裂解，条带易显示，但内参GAPDH条带浓且易连成一条线，若按1∶9的比例裂解，条带不易显示；④一旦实验计划裂解心肌，需连续实验至95 ℃ 10 min变性完毕这一步，实验不要中断，否则蛋白质易降解，导致内参GAPDH条带不齐；⑤电泳槽的内槽应先加满电泳液并观察电泳槽内槽底端是否有电泳液漏出，若有电泳液漏出，则需重新夹紧玻璃板，作者实验时曾出现过电泳完毕溴酚兰不成一条直线而呈拱形，发现是因为电泳槽内槽漏液所致；⑥转膜液一定要提前充分预冷。电转槽的3/4部分整个转膜过程均必需置于冰水混合液体中。10 min后电转槽接通电源较好，此有利于整个转膜体系温度能够提前降下来，低温关系到转膜的成败；⑦大鼠心肌小分子量炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)Western blot转膜条件为恒流250mA、1 h较好[9-10]，而大鼠心肌炎性因子(NF-κB，65kD，CST8242)Western blot转膜条件为恒流400mA、1 h较好；⑧孵育一抗后以及孵育二抗后TBST洗膜，洗3次，每次10 min，这是最低要求，如果背景不干净，建议增加TBST洗膜次数；⑨内参是Western blot不可或缺的，如果Western blot内参做不出，实验无法进行下去。内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，如β-actin、tubulin、GAPDH等。作者在检测大鼠心肌蛋白时选用GAPDH作为内参。如果Western blot实验，建议首先做一次所有标本的GAPDH，内参条带如果不齐，建议重新定蛋白；⑩选择好的一抗至关重要，尽量选择单克隆抗体而不是多克隆抗体。