Scn3b在遗传性糖尿病长爪沙鼠多种组织中的表达情况*

赵培琨 龚菁菁 杜小燕 李长龙 霍学云 路 静 吕建祎 刘 欣 陈振文 郭 萌

(首都医科大学基础医学院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes mellitus)是当今全球范围威胁人类健康的重大疾病之一，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人类健康的重要慢性非传染性终身疾病。随着国人生活方式发生改变和老龄化进程的加速，我国糖尿病的患病率呈现显著上升趋势。近年来，我国成人糖尿病患病率平均为11.6%，患病人数已达到1.14亿[1]。其中2型糖尿病(T2DM)约占糖尿病患者数的90%[2]。2型糖尿病是由遗传因素和环境因素共同作用的发病因素复杂的疾病，以葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗为主要特征[3]。2型糖尿病作为一种多基因控制的疾病，查找确定易感基因对于2型糖尿病发病的研究至关重要。通过糖尿病动物模型筛选易感基因成为研究的重要方法。长爪沙鼠具有独特的解剖学、生理学特征，对于代谢性疾病具有极为重要的应用价值[4]。本课题利用自行培育近交系长爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通过抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)的方法在糖尿病和正常血糖长爪沙鼠骨骼肌中发现控钠通道β3亚基基因Scn3b差异表达。钠离子通道是一种跨膜蛋白复合体，包含一个孔道结构的α亚基和一个或多个能够调节通道状态且能够与其他多种蛋白互作的β亚基[5]。其中β3亚基由Scn3b基因编码，广泛分布于各种细胞膜，主要参与心脏电生理活动。但是其是否参与糖尿病的发生目前尚未知晓。因此，本文主要研究Scn3b在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝脏、肾脏、骨骼肌、脑组织和心脏中的表达情况，为探究长爪沙鼠糖尿病模型致病机制中Scn3b的作用和靶器官奠定基础，从而为长爪沙鼠2型糖尿病模型发生机制的研究开拓新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取近交系自发糖尿病长爪沙鼠和对照正常血糖沙鼠，本文中分别用High和Control表示，每组各6只，雌雄各半，12～15周龄。所有长爪沙鼠均来自首都医科大学实验动物部，饲养于控制恒温恒湿的普通环境中。动物自由饮普通水和采食，饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。室温为(22±2)℃，相对湿度40%～70%，人工光照明暗各12 h。

本实验中所采用的两组动物的空腹血糖数值如下：

空腹血糖mmol/L对照组4.9±1.0高血糖组6.7±0.7

糖耐量分别取0 h，0.5 h，1h和2 h的血糖数值，进行统计，结果如图1。

图1 糖尿病组和正常对照组长爪沙鼠的糖耐量试验

1.2 样品采集

动物施过量麻醉安乐死，解剖采集新鲜糖尿病模型和正常对照长爪沙鼠的肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织，之后立即置于液氮中。

1.3 RNA提取及cDNA制备

从液氮中各取出冻存的长爪沙鼠6种组织约30 mg分别移入均质管内，加入TRIzol试剂1 mL(Invitrogen，USA)和磁珠，剪碎后用均质器将组织彻底打碎，室温放置1 min，加入200 μL三氯甲烷，混匀静置15 min，4℃ 14 000 r/min 离心15 min，转移上层液体至另一离心管，其中加入500 μL异丙醇，混匀静置10 min，4℃ 14 000 r/min 离心15 min，弃去上清液。加入70%乙醇900 μL，洗涤沉淀，4℃12 000 r/min 离心10 min，弃去上清液。以上步骤重复1次。室温自然干燥，加入适量的RNA-Free水溶解得到总RNA。利用Nanodrop 2 000c(Thermo scientific, USA)分析RNA浓度和纯度。

cDNA的制备:利用快速反转录试剂盒(天根生化科技有限公司,北京)对上述总RNA样品进行逆转录。首先进行gDNA去除反应，5×gDNA Buffer 2μL，总RNA，去核酶水补足到10μL，42 ℃孵育3 min。之后进行反转录，10×Fast RT Buffer 2μL，FQ-RT Primer Mix 2μL，RT Enzyme Mix 1μL，去核酶水补足到10μL。此配好液体加入此前去除体系中，42 ℃孵育15min，95℃ 3min，得到相应的cDNA，-20 ℃保存。

1.4 Real-time PCR

按照SSH得到的Scn3b基因片段序列设计引物，利用 Primer Premier 5.0 设计PCR扩增引物多对。各组织选取Gapdh作为内参基因并设计引物。引物序列如表1所示，均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

表1 Real-timePCR引物序列

利用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上对Scn3b的mRNA水平进行检测。所用试剂为实时定量PCR试剂盒(天根)，反应体系为20μL。反应条件如下: Real-time PCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.6μL，模板cDNA 1μL，RNA-free H2O 7.8μL。反应程序均为: 95℃15min，之后95℃ 10 s，60 ℃ 30s，共扩增40个循环，每个循环结束时检测荧光; 熔解曲线分析从60 ℃到95℃，每0.5 ℃检测一次。

1.5 Western blotting

取液氮冻存的长爪沙鼠骨骼肌、肝脏、肾脏、脂肪、心脏和脑组织，剪碎后用组织蛋白提取试剂盒(康为世纪)提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。取30 μg总蛋白进行SDS-AGE凝胶电泳分离，电转蛋白至硝酸纤维素膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脱脂奶粉(CST, USA)和0.05% Tween-20 封闭过夜。将膜与anti-Scn3b抗体(1∶1 000稀释，abcam, USA)4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，与二抗(辣根过氧化酶联的抗兔血清)室温孵育1 h，TBST洗膜后用化学发光法显色。肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织做免疫印迹时内参基因选用Gapdh作为内参基因。最后用凝胶图像分析系统(Bio-Rad)扫描蛋白质印迹条带灰度。

1.6 统计方法

所有数据均利用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验方法分析。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Scn3b基因在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4种组织中的表达差异

利用Real-time PCR法分别检测糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠的肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织Scn3b的mRNA表达水平。如图2所示，在肝脏组织中，糖尿病组Scn3b的mRNA表达水平显著低于正常对照组，在骨骼肌和脑组织中，糖尿病组Scn3b的mRNA表达水平也具有低于正常对照组的趋势。然而在肾脏中，糖尿病组和对照组间Scn3b的表达无差异。

2.2 Scn3b蛋白在糖尿病沙鼠和正常血糖沙鼠4种组织中的表达差异

Western Blotting检测Scn3b蛋白在4种组织中的表达，结果显示在肝脏中糖尿病组的蛋白表达水平显著低于对照组，与Real-time PCR结果一致(图3A)。而在脑组织中，Scn3b糖尿病组的蛋白表达水平也具有低于对照组的趋势(图3D)。然而，在肾脏和骨骼肌中，Scn3b在糖尿病组和对照组则无明显差异(图3B-C)。

图2 Scn3b在糖尿病组和正常对照组长爪沙鼠4种组织中的mRNA表达水平

3 讨论

糖尿病是一组由多种病因引起的，以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，全身多组织和重要器官的功能与代谢都会受到影响。本研究选取肝脏、肾脏、骨骼肌和脑组织进行分析。肝脏作为哺乳动物物质代谢最主要器官，参与三大类物质的代谢与转化，通过肝糖原合成参与糖类代谢，对糖分调节、分布和转化有重要意义，也是胰岛素作用的重要靶器官[6]。骨骼肌作为葡萄糖与脂肪酸代谢器官，在胰岛素作用下吸收血糖，缓冲血糖变化，对于全身糖代谢有重要意义。肾脏作为糖尿病主要受累器官，糖尿病会引发肾脏小血管病变，出现一系列肾脏功能不全的症状[6]。同时糖尿病还会累及脑组织，脑内线粒体利用葡萄糖，代谢产生的活性氧引起组织的氧化应激，造成脑组织的病理状态[6]。因此我们选取这几种组织作为研究的切入点。2型糖尿病在糖尿病人群中所占比例最高[7]，其发病机制作为近年来的研究重点，其中遗传因素作为已知的最关键因素之一。所以寻找和确定易感基因成为2型糖尿病发病研究的关键所在,之后通过SSH从之前定向培育逐步形成的长爪沙鼠自发糖尿病模型动物群体的骨骼肌中，筛选出糖尿病组和正常组长爪沙鼠中的表达差异基因。本研究挑选出了其中可能与糖尿病和代谢相关的候选基因Scn3b进行不同器官组织表达分析。

此前有研究发现敲除α亚基Scn3a或调节型亚基Scn1b，能够减少葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌[8-9]。因为胰腺β细胞是具有电生理活性的，胰岛素的释放依赖于动作电位的产生，通过电压门控钙离子通道活化,胞内钙离子浓度增加，激发胰岛素囊泡向胞外释放[10-12]。然而，Scn3b在糖尿病靶组织中的作用却尚无报道。在本实验中，我们发现，Scn3b在糖尿病组肝脏和脑组织中mRNA和蛋白水平均下降且与SSH趋势一致。肝脏参与维持血糖的稳定，在胰岛素作用下抑制糖原分解，促进糖原合成。在糖尿病组动物肝脏中Scn3b的mRNA和蛋白水平的显著下降，提示Scn3b可能参与肝脏血糖分解代谢与糖原合成，其异常降低可能与糖异生异常相关。脑组织以葡萄糖作为最主要的供能物质，作为机体代谢最旺盛的器官，也是葡萄糖代谢的另一重要场所。糖尿病动物脑组织中Scn3b的mRNA和蛋白水平也有一定下降趋势，我们推测Scn3b可能也与脑组织血糖代谢与利用有关。以上结果提示，肝脏和脑组织可能是Scn3b基因参与糖代谢的靶器官。

总之，长爪沙鼠糖尿病模型中Scn3b的表达变化，显示出其与糖尿病发生可能具有相关性，尤其是在肝脏和脑组织中，这为糖尿病发病的分子机制研究以及进一步深入研究2型糖尿病的防治提供一个新的研究角度。