STR扫描技术对融水小型猪群体遗传结构的分析*

刘 科 施赫赫 谭巧燕 陈 淦 唐小江

(1. 广东省医学实验动物中心，佛山 528248)(2. 广东贝格生物科技有限公司，佛山 528100)

融水小型猪是源自广西融水县苗寨的小黑猪，具有体型小、性情温驯、母性较好、产仔力强等特点，具有培育成标准化实验用小型猪的有利特点[1]。我们于2012 年将该猪种源引到广东三水繁育，建立了基础种群的系谱档案，已繁殖出F1 代和F2 代，参照北京市地方标准[2]初步建立了融水小型猪的质量控制标准，并开展了融水小型猪实验动物化研究，包括环境、营养、生长、生理生化、组织病理、线粒体DNA结构和系统进化等[1, 3-6]。为了进一步掌握融水小型猪群体遗传结构，本文通过STR(Short tandem repeat)扫描技术分析了融水性小型猪F1代群体的遗传结构。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物样品：在广东省医学实验动物中心小型猪研究基地融水小型猪F1代群体中随机抽取非同窝的30头，年龄性别不限。各融水小型猪具体信息见表1。

1.1.2仪器及试剂：EDC-810 PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司；3730XL基因测序仪，ABI公司；Allegra 25R台式高速冷冻离心机，Beckman(贝克曼)公司；GeneScanTM-120 GeneScan，ABI公司； Taq DNA 聚合酶、dNTP购于Fermentas公司；ROX标记分子量内标、GK1041，上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 融水小型猪样本信息

1.1.3STR位点：选用北京市地方标准封闭群实验用小型猪的遗传质量监测提供的25个微卫星位点及引物序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物。具体位点名称、引物序列及PCR反应条件见表2。

表2 25个STR位点名称、引物序列、片段大小及PCR条件

1.2 方法

1.2.1DNA提取：用无菌EDTA抗凝采血管取融水小型猪前腔静脉血4 mL，用上海捷瑞生物工程有限公司生产的GK1041试剂盒按操作说明书提取DNA。

1.2.2PCR及琼脂糖凝胶电泳：PCR反应体系为15 μL，其中10×buffer 1.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.15 μL，DNTP 10 m mol/L 0.3 μL，Taq酶0.3 μL，5～10 ng基因组DNA 1μL，纯水(H2O)：10.25 μL。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，最适退火温度15 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，接72 ℃继续延伸3 min，扩增产物4 ℃保存。取部分扩增产物8 μL经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，成相拍照。

1.2.3STR扫描: 根据琼脂糖凝胶电泳结果估计PCR产物浓度，并将产物稀释10倍后，与ROX 500内标混匀，其中10倍稀释的PCR产物1.5 μL，ROX标记的分子量标记0.25 μL，超纯去离子甲酰胺12.5 μL，95 ℃ 5 min，迅速冰浴3 min，置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测。本次实验检测为三色通道荧光检测体系，分别为FAM、HEX、ROX，实现每通道同时检测两种STR类型(根据标记的不同，这里为FAM和HEX)。

1.2.4STR扫描结果分析：扫描结果若只有一个主波的为纯合基因型，如果有两个主波则为杂合基因型。同时将每个STR扫描标记的基因片段大小按照由小到大的顺序分别标记为a、b、c、d、e等。将30头融水小型猪的25个微卫星标记的基因型按照aa、ab、bc等格式输入Popgene32软件，分析融水小型猪观察等位基因数、有效等位基因数、香隆指数、有效杂合度等。

2 结果

2.1 25个位点PCR电泳凝胶图

琼脂糖凝胶电泳结果显示，全部25个位点扩增良好，电泳条带清晰，电泳凝胶结果见图1。

图1 25个位点PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 STR扫描结果

STR扫描结果显示，全部25个微卫星位点具有丰富的多态性，纯合及杂合基因型从扫描图中清晰可见。SW951位点STR扫描结果(选取2个个体)见图2、3。

图2 SW951位点纯合子基因型STR扫描结果

图3 SW951位点杂合子基因型STR扫描结果

2.3 融水小型猪群体遗传分析结果

将从STR扫描得到的信息输入Popgene32后分析得到30头融水小型猪在25个位点上的观测等位基因数，有效等位基因数，香隆指数及有效杂合度原始数据及汇总见表3。30头融水小型猪在25个位点上的平均观测等位基因数为9.4400，平均有效等位基因数为5.2966，平均香隆指数为1.8085，平均有效杂合度为0.7737。

表3 30头融水小型猪在25个位点上的观测等位基因数、有效等位基因数、香隆指数、有效杂合度

3 讨论

微卫星DNA(Microsatellite DNA)，又称短串联重复序列(Short tandem repeat, STR)或称简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)，是一种以2～6个核苷酸为基本重复单位的简单串联重复序列。近年来，微卫星标记因具有分布广、数量多、高度多态性、具有共显性等优点，被作为一种重要的遗传工具广泛应用于各类实验动物的遗传检测和评定研究。特别是近年来快速发展和具有广泛应用前景的DNA全自动测序仪的毛细管凝胶电泳新技术(STR扫描技术)，具有微量、高度自动化、结果更加准确等明显优势，成为微卫星检测的发展方向。本试验选用北京市地方标准封闭群实验用小型猪的遗传质量监测(DB11/T 828. 3—2011)提供的25个微卫星位点，对建立的融水小型猪F1代群体进行遗传检测，其位点引物涵盖了小型猪17对常染色体及X性染色体，试验结果显示，18对染色体均得到对应的微卫星位点，全部25个位点扩增良好，均可扩增出目的条带，电泳条带清晰，对30个融水小型猪样本检测，各位点多态丰富，25个位点观察等位基因数5～16，有效等位基因数2.3407～10.1695，平均有效等位基因数为5.2966，等位基因较多，表明选取的25个微卫星位点适用于融水小型猪遗传结构分析。

融水小型猪是源自广西融水县苗寨的小黑猪，前期研究表明[1,3-6]，融水小型猪具有体型微小、性情温驯、母性较好、产仔力强等特点，具有培育成标准化实验用小型猪的有利特点。我们于2012年将该猪种源引到广东繁育，建立基础群130头，其中雌性120头，雄性10头。经驯化、选育，建立了F1代融水小型猪群体。目前，已对融水小型猪繁殖群体进行了基础研究，但群体的遗传结构还不清楚。本试验所选取的30头F1代融水小型猪个体(抽样F1代群体120头，雌性90头，雄性30头)年龄在1年到3年之间，样本选择尽可能避免亲缘关系较近个体，基本能够反应目前融水小型猪群体的总体遗传概况。试验结果显示，30头F1融水小型猪在25个平均观测等位基因数为9.4400，平均有效等位基因数为5.2966，说明群体非近亲繁殖，基因较稳定。香隆指数是衡量微卫星DNA多态性的指标，香隆指数高则表明该微卫星位点的多态性越好[7]。该融水小型猪F1代群体的平均香隆指数为1.8085，是属理想范围，这也与微卫星多态性丰富的数据分析结果相吻合。群体平均有效杂合度是一个群体遗传多样性程度的重要指标，能够反映群体中检测的基因的杂合状态。一个理想封闭群的平均有效杂合度在0.5～0.7，若群体杂合度小于0.5则表明群体的遗传多样性较差，而大于0.7则表明群体离散度较高，个体间差异偏大[7-9]。该试验用平均有效杂合度为0.7737，杂合度略偏高，这可能与种源个体来源，及该种群引入后第一代采用分组交配方式繁殖，封闭繁育代数较少，还未形成封闭群相关，同时说明建立融水小型猪封闭群还需进一步培育、繁殖。

本实验通过STR扫描技术分析了融水小型猪的遗传结构，为融水小型猪实验动物化和标准化研究奠定了基础，有利于融水小型猪群今后繁殖育种计划的制定，同时也为小型猪遗传分析方法提供了参考和依据。