甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的体液免疫影响*

金 晓 李晓红 贾森泉 胡凝珠 胡云章

(1.中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所 云南省虫媒传染病防控研发重点实验室，昆明 650118) (2.昆明医科大学，昆明 650500)

疫苗是人类防控传染性疾病最有效的手段，接种疫苗估计每年可避免超过250万例死亡[1]，市场上投入使用的疫苗一般是由抗原和佐剂组成，免疫佐剂对于疫苗作用的发挥起着至关重要的作用。佐剂能够迅速激活免疫系统，这对于免疫力低下的儿童和老人意义就显得更加重要[2]。生物信息学、结构生物学和反向遗传学等技术的发展，为未来新型疫苗的研发提供了新的方向和思路，新疫苗的迅速发展使佐剂安全性和疫苗免疫原性增强效应受到关注[3]。目前已被批准应用于人类的佐剂，包括铝盐佐剂、MF59、AS03、AS04和脂质体，但是一些局部皮肤炎症反应、IgE抗体反应和安全性等问题仍不容忽视。因此开发新型高效、经济、无副作用的免疫佐剂是未来佐剂研发的核心任务[4-5]。

甘油-3-磷酸(Glycerol-3-phosphate，G3P)，是原核生物、植物、动物和人类生长过程中非常重要的物质，并且是与疾病相关的重要代谢物，是人体糖酵解和脂肪代谢通路中重要的组成部分[6]。中链脂肪酸甘油三酯(MCT)在酯酶的作用下水解为游离脂肪酸和甘油，肝细胞摄取甘油并且在甘油激酶的作用下反应生成甘油-3-磷酸。有证据表明中链脂肪酸甘油三酯(MCT)能够增强免疫应答和改变免疫应答的类型[7-8]。目前没有报道甘油-3-磷酸在动物实验上是否有增强免疫应答的作用，但是G3P是植物中广谱抗原诱导剂的重要形式，称为系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。原发感染引起SAR，并保护远端组织免受继发感染，G3P生物合成缺陷的遗传突变体不能诱导SAR，只有当G3P外源供应时才可重新诱导SAR，因此G3P就起到一个增强免疫应答的作用[9-10]。有关证据表明，植物中的G3P水平与真菌病原菌希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)的防御作用有关，G3P的增加可增强拟南芥抵御希金斯炭疽菌侵害的作用[11]。在藻类植物中也含有一些抗菌物质的活性，并且他们在动物身上也起到一个类似于植物的抗病毒的活性，有文献报道，藻类中的海洋硫酸多糖911可增强机体免疫能力[12]。那么甘油-3-磷酸是否也像藻类植物中的多糖一样不仅在植物中有免疫增强作用，而且在动物的免疫应答方面也能起到佐剂效应呢，因此我们对其免疫佐剂效应进行了研究。

1 材料与方法

1.1 疫苗

甲型肝炎减毒活疫苗，抗原滴度为18EU/mL，本实验室保存。

1.2 实验动物

ICR雌性小鼠49只、年龄为6～8周、体质量约为18～22 g/只，SPF级，购自中国医学科学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心[SCXK(滇) K2014-0002]。

1.3 主要试剂

甘油-3-磷酸，又称甘油磷酸酯，购自J&K，CAS NO. 57-03-4；Al(OH)3佐剂由本实验室保存提供，浓度为12.5 mg/mL；抗HAV IgG ELISA检测试剂盒购自KPL公司。

1.4 实验分组与免疫

将ICR雌性小鼠分为7组，每组是7只，分别为HAV对照组，铝佐剂对照组，阴性对照组(生理盐水组)和四组不同剂量的甘油-3-磷酸组，按表1配比后混合，分别皮下免疫一次，每只300 μL。

表1 动物分组

1.5 抗HAV IgG抗体水平检测

在初次免疫以后的第4、第8、第12、第16、第20周，分别采小鼠尾部静脉血100 μL左右，37 ℃静置1 h，然后4 ℃静置4 h，吸取上层血清备用。用酶联免疫吸附试验(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)检测抗HAV IgG，操作按照试剂盒说明书进行。

1.6 甘油-3-磷酸的安全性观察

在整个试验期内，观察小鼠是否有异常反应，例如掉毛、体质量减轻、炎症反应等表现，观察小鼠身体状况。于免疫20周后，分别取甘油-3-磷酸2 mg组和阴性对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺组织，依次经甲醛固定、70% ～ 100%酒精脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色，在电镜下观察各组织的病理变化。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 甘油-3-磷酸的体液免疫效果

2.2 甘油-3-磷酸作为HAV抗原佐剂的安全性检测

安全性检测结果显示,小鼠都没有发生呼吸困难、掉毛、挠鼻、痉挛、休克等异常反应；生活习性均正常。病理切片观察发现甘油-3-磷酸2 mg小鼠与阴性对照组小鼠的肺、肝、心、脾、肾的组织切片一切正常，未发生异常组织变化，结果见图2，表明在甘油-3-磷酸2 mg剂量组具有很好的安全性。

表2 不同组小鼠血清中抗HAV IgG抗体水平比较

注： 抗HAV IgG用lg表示。与单纯抗原组比，*P<0. 05，差异有统计学意义：与铝佐剂组比较，#P<0. 05，差异有统计学意义 Note: Anti-HAV IgG is showed with lg compared with antigen group，*P<0.05 is showed significant difference；compared with Al(OH)3group，#P<0.05 is showed significant difference

图1 不同组别小鼠血清中抗HAV IgG抗体水平比较

图2 甘油-3-磷酸2mg实验组和阴性对照组的小鼠各脏器的病理学观察(×10)

3 讨论

疫苗是人类用来预防疾病的关键用品，要想疫苗发挥其最好的效果，佐剂的选择就非常重要，佐剂的发展与新型疫苗的研发是相互密切联系、相互促进的，虽然现在有很多新型疫苗佐剂的研究，但是要真正用到疫苗生产当中，还需要继续努力研发，现在应用最广泛的佐剂依旧是铝佐剂，但是对于小分子量抗原，铝佐剂对其免疫应答增强效果较弱，且它的副作用不可忽视，因此一个广谱，高效，经济，无副作用的新型佐剂的研发迫在眉睫[13]。

目前国际上获得认证的佐剂有铝佐剂、MF59、AS03、AS04、脂质体[14]；铝佐剂是目前应用最广泛的疫苗佐剂，被美国FDA批准应用于人类，铝佐剂价格便宜，吸附作用好，APC能够摄取铝佐剂上吸附的抗原，但其不良反应值得关注，如皮疹、IgE介导的超敏反应、甚至有报道称可以引起神经毒性[15]。MF59主要是用于流感疫苗中，是一种水包油佐剂，有发生炎症性关节炎风险。AS03、AS04已被欧洲国家认可且应用于人类，但是AS04成本较高，AS03有诱发炎症性关节炎的风险。脂质体用于HAV疫苗，虽能够诱发强烈的免疫应答，但是由于稳定性问题使脂质体在生产上有一定的困难且相对成本比较高，这对疫苗的广泛使用造成了一定的限制[16-17]。本实验主要是讨论甘油-3-磷酸在免疫应答中的作用，结果显示其可以提高HAV诱导产生特异性的抗HAV抗体，在第4周的抗体效价明显超过铝佐剂组，并且有统计学差异。在第8周时抗体效价最高，并且抗体效价与铝佐剂相差不大，没有统计学差异，因此甘油-3-磷酸诱导HAV产生特异性的抗HAV抗体要比铝佐剂的诱导更迅速，如果遇到突发传染病，能够迅速引起免疫应答就显得非常重要，同时还可作为天然的油脂来代替疫苗中添加的矿物油脂。甘油磷酸是一种生理性物质，与外源性物质相比其作为佐剂理论上具有更好的安全性。相比已经认证使用的这些佐剂，甘油-3-磷酸具有经济，高效，安全等新型疫苗佐剂应有的特点，为发现新型疫苗佐剂提供新思路。现在已经发现来源于人类本身的一些物质就有诱导免疫应答的作用，例如硫酸乙酰肝素，犬尿氨酸，尿苷二磷酸等，可以有效增强小鼠的体液免疫应答，且安全性良好，具有开发为新型疫苗佐剂的潜力[18-20]。

综上所述，甘油-3-磷酸能够增强HAV诱导的小鼠体液免疫应答，并且反应性要比铝佐剂快，而且甘油-3-磷酸是动植物糖类和脂类代谢的中间物，避免了外源性物质对小鼠的刺激，安全性良好，非常符合新型佐剂高效、经济、安全的条件，希望甘油-3-磷酸能够开发为新型佐剂，应用到疫苗的生产当中，为人类的公共卫生事业做出贡献。