普洱茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的研究进展

吕海鹏，王梦琪，张 悦，朱 荫，林 智,*

（1.农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

黑茶是我国六大茶类之一，主要有普洱茶、茯砖茶、六堡茶、青砖茶及四川边茶等类型，长期以来是我国边疆少数民族同胞日常生活中重要的饮品[1]。普洱茶产于云南，是通过其加工原料（晒青毛茶）在高温高湿的环境条件下经微生物参与的后发酵工艺制成的，因成茶具有特殊的风味品质和减肥降脂等保健功效，近年来远销东南亚及欧美市场，也引起了食品学、医药学、微生物学等相关领域科研工作者的关注[2-3]。多酚类成分是茶叶中的重要品质化学成分，它在茶叶中含量高且对茶叶风味品质和保健功效具有重要贡献，长期以来一直是茶叶化学的研究焦点之一。现有研究表明，在后发酵过程中，晒青毛茶中的多酚类成分除了以氧化聚合和生物降解等为主的转化方式外，还有少部分多酚类成分发生了化学结构修饰，由此形成了一系列对普洱茶风味品质及生物活性有重要影响的多酚类成分化学结构修饰产物。本文综述了普洱茶中多酚类成分衍生物的研究进展情况。

1 多酚类成分在普洱茶后发酵加工过程中的变化

茶叶中的多酚类成分一般包括黄烷醇类（以儿茶素类为代表）、黄酮及黄酮苷类（以山柰酚、槲皮素以及杨梅素及其糖苷类为代表）、花青素和花白素以及酚酸类（酚酸和缩酚酸类化合物）等化学成分[1]。目前，人们已经针对绿茶、红茶、乌龙茶以及白茶等非微生物发酵茶中的多酚类化学成分开展了较为系统的研究。然而，因为普洱茶以及其他黑茶中的多酚类化学成分在后发酵加工过程中涉及微生物参与的生物转化过程，所以黑茶中的多酚类成分的化学结构和化学组成要比绿茶、红茶和乌龙茶等更为复杂。研究表明，微生物参与的后发酵过程在普洱茶的品质形成中发挥了至关重要的作用[4-5]，奠定了普洱茶品质的化学物质基础；许多微生物参与了普洱茶的后发酵过程，曲霉菌属微生物被认为是普洱茶后发酵过程中的优势菌种[6-8]，其中黑曲霉菌（Aspergillus niger）最受关注，它能生产多酚氧化酶、单宁酶、果胶酶、纤维素酶以及其他多种酶类[9]。在不同茶类化学成分比较方面，邵宛芳等[10]分析了红茶、普洱茶及二者的加工原料——蒸青叶及青毛茶的水溶性多酚类物及其氧化产物，发现蒸青叶及青毛茶的色谱图很相似，而红茶与普洱茶的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）谱图截然不同；红茶保留较多的未氧化多酚类，并含有一定量的黄酮糖苷（flavonol glycosides，FG）、茶黄酸（theaflavic acids，TFA）、茶黄素（theaflavins，TF）及茶红素（thearubigins，TR）；而普洱茶只含有少量的未氧化多酚类物、FG及一定量的TR，且不含TFA及TF。

晒青毛茶中的多酚类成分在后发酵过程中的变化最为剧烈，含量呈现出明显的降低趋势，这已被许多研究证实。例如，罗龙新等[11]跟踪研究了昆明茶厂生产普洱茶的过程，发现在渥堆结束后，茶多酚总量减少了60%以上，儿茶素含量则减少了80%左右。此外，李家华等[12]分析了晒青毛茶原料及其不同发酵阶段翻堆样中主要黄酮醇类物质含量的变化规律，发现它们的含量一直呈下降趋势，发酵结束时出堆样中杨梅素含量与原料相比下降近50%，槲皮素含量下降70%，而山柰酚含量下降62%。

由以上分析可见，在高温高湿的渥堆环境条件以及微生物分泌的胞外酶的作用下，晒青毛茶原料中以多酚类成分为代表的众多化学成分发生了一系列复杂的诸如氧化、聚合、缩合、分解等电化学变化，并由此可能形成了众多新的化学物质成分。这些新的化学成分具有重要的研究价值，在一定意义上，它们可能有效促成了普洱茶独特的风味品质特征（例如香气陈醇、滋味醇厚、汤色红褐等），并赋予了普洱茶重要的保健功效（例如降脂减肥等）。

发酵过程中多酚类成分含量大幅减少，其生物转化的具体途径和方式是什么？查明这个问题对于阐明普洱茶风味品质的形成及其化学本质具有重要价值。

2 普洱茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的主要可能途径

图1 普洱茶后发酵过程中多酚性化学成分的转化[11-40]Fig.1 Microbial biotransformation of tea polyphenols during the pile fermentation of Pu-erh tea[11-40]

一般认为，晒青毛茶中的多酚类化学成分，在后发酵过程中的转化途径以氧化聚合（例如普洱茶中酚性成分的大量消失[11-12]和茶褐素的大量形成[13-14]）和生物降解（例如从表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）到表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）和没食子酸（gallic acid，GA）[15-16]等）为主；此外，现有研究发现，还有少部分多酚类化学成分在微生物分泌的胞外酶的作用下发生了化学结构修饰（图1）。已经证实，这些修饰产物在普洱茶风味品质化学以及生物活性中也发挥了重要作用，展现出重要的研究价值和研究意义。如图2所示，归纳目前相关的文献报道，普洱茶中多酚类成分化学结构修饰的主要类型至少包括以下几种。

图2 已经鉴定出的普洱茶部分多酚类成分的化学结构修饰产物[30-34]Fig.2 Identified derivatives of polyphenol compounds during the pile fermentation of Pu-erh tea[30-34]

2.1 糖基化（或脱糖基化）修饰

糖基化（或脱糖基化）修饰可能是晒青毛茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的一种重要方式。目前，普洱茶中大量的多酚类成分的糖苷化合物逐渐被鉴定出[2,17-19]。例如，张梁等[17]采用各种色谱技术进行分离，利用波谱法结合化合物的理化性质确定结构，在普洱茶乙酸乙酯萃取物中最终分离、鉴定了8 个黄酮类糖苷化合物，分别为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-芸香糖苷、芹菜素6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷、牡荆素-4’-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基（1→3）α-L-鼠李糖基（1→6）β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、杨梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷；再如，福建省农业科学院采用HPLC-电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱（HPLC coupled to electrospray ionisation and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，HPLC-ESI-QTOF-MS/MS）技术，从普洱茶中鉴定出了20 种黄酮成分的糖苷化合物，包含O-糖基化黄酮醇、C-糖基化黄酮、酰化糖基化黄酮醇等不同类型[19]；另外，郭雪梅等[20]研究发现，普洱茶茶褐素组分中存在着大量的糖信号；茶褐素组分是由槲皮素、山柰酚还有大量的糖构成的，茶褐素组分是可以结合1～4 个不同糖苷元，形成一系列以槲皮素和山柰酚为母核的黄酮氧苷化合物。随着研究的深入，普洱茶中新的糖苷类成分不断发现，例如2016年报道的槲皮素3-O-β-L-鼠李糖酰-（1→6）-（2-E-对香豆酰）-β-D-葡萄糖苷-4’-O-β-L-鼠李糖苷（quercetin 3-O-β-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-(2-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside-4’-O-β-L-rhamnopyranoside）[21]和2017年报道的槲皮素-对香豆酰-鼠李糖酰-阿拉伯糖酰-己糖苷（quercetin-3-O-p-coumaroyl-rhamnosyl-arabinosylhexoside）[19]等。

在晒青毛茶的渥堆过程中，李家华等[12]发现总黄酮醇苷含量在整个发酵阶段都呈极显著减少趋势，总黄酮醇苷含量从原料中的15.71 mg/g降到了渥堆结束时的5.32 mg/g；这种去糖基化修饰过程，可能是在发酵过程中微生物产生的糖苷酶水解黄酮糖苷生成杨梅素类、槲皮素类和山柰酚类之外的某些游离态黄酮醇苷元所致。茶叶中的黄酮醇类物质对其汤色和滋味等感官品质有显著影响。研究发现，黄酮醇苷类呈柔和感涩味，且阈值极低，是红茶中的重要涩味物质[22]；此外，槲皮素与绿茶茶汤色泽相关性较明显（R＝0.764 7），而与红茶的相关性更高（R＝0.848 6）[23]。在发酵过程中可以通过合理控制发酵时间、堆温、发酵车间的湿度、微生物种群和数量等达到普洱茶黄酮醇类的均衡降解与转化，保持成品茶中黄酮醇类的适度含量。保持其生物活性等是统一普洱茶品质、提高普洱茶质量的重要保证之一[12]。

2.2 甲基化修饰

甲基化修饰可能是普洱茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的另一种重要方式。目前的研究已经在普洱茶的挥发性成分和非挥发性成分中都鉴定出了一些多酚类成分的甲基化修饰产物，也证明了这些甲基化的修饰产物对普洱茶的风味品质和生物活性产生了重要影响。

在普洱茶的挥发性成分研究中，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME/GC-MS）分析技术[24-25]，发现了大量的以1,2,3-三甲氧基苯、1,2-二甲氧基苯、3,4-二甲氧基甲苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基-5-甲基-苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯、1-乙氧基-4-甲基-苯、1-甲氧基-4-（2-丙烯基）-苯、1,2-二甲氧基-4-（1-丙烯基）-苯以及1,2,4-三甲氧基-5-（1-丙烯基）-苯为代表的酚性甲氧基成分；并通过在线嗅闻技术，证明了这些甲基化成分是普洱茶“陈香”的关键致香成分之一；另外，这些成分一般被认为是在微生物作用和热降解作用双重作用条件下，通过GA的甲基化修饰形成的[26]。

在普洱茶的非挥发性成分中，也已鉴定出了一些多酚类成分的甲基化修饰产物，并发现这些甲基化的多酚类成分与普洱茶的生物活性可能存在着一定的联系。例如，采用HPLC制备色谱等分析了普洱茶乙酸乙酯提取物E8组分（该组分被证实具有较强的抗氧化活性[27]）的化学成分，并通过LC-MS和核磁共振等对制备得到的化合物进行了结构鉴定，结果从E8组分中分离鉴定出3 个甲基化的黄酮化合物，分别为3’,4’,5-三羟基-7-甲氧基黄酮、3’,4’,7-三羟基-5-甲氧基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷和3’,4’,7-三羟基-5-甲氧基黄酮[28]；另外，在对普洱茶降脂活性关键物质的研究中，从降脂活性最强的组分中采用HPLC-MS/MS技术鉴定出了一种甲基化的黄酮类成分（pollenitin）[29]。

2.3 主要发生在黄烷醇和黄酮醇A环上取代等方式的结构修饰

主要发生在黄烷醇和黄酮醇A环上取代等方式的结构修饰可能是普洱茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的第3种重要方式。通过发生在黄烷醇和黄酮醇A环上的取代等方式的结构修饰，形成了普洱茶中一些新的多酚类化学成分的结构修饰产物，这些衍生物成分往往是普洱中重要的标志性成分。归纳现有文献报道，已经鉴定出的相关化合物主要有如下4 种类型：1）金鸡纳素型氧化黄烷醇类内酯化合物[30-31]：例如从普洱茶中鉴定出来的2 个新的8-C取代的黄烷-3-醇成分（puerins A和B）和2 个已知的金鸡纳素型多酚性成分：表儿茶素[7,8-bc]-4-（4-羟苯基）-二氢-2（3H）-吡喃酮（epicatechin-[7,8-bc]-4-(4-hydroxyphenyl)-dihydro-2(3H)-pyranone）和金鸡纳素lb。2）羧基和羧甲基取代的黄烷醇成分[32]：例如从普洱茶中鉴定出来的4 个新的羧基和羧甲基取代的黄烷-3-醇成分，即8-羧甲基-（+）-儿茶素（8-carboxymethyl-(+)-catechin）、8-羧甲基-（+）-儿茶素甲酯（8-carboxymethyl-(+)-catechin methyl ester）、6-羧甲基-（+）-儿茶素（6-carboxymethyl-(+)-catechin）以及6-羧基-（-）-没食子儿茶素（6-carboxyl-(-)-gallocatechin）。3）苯丙素取代的黄烷醇成分[33]：例如从普洱茶中鉴定出来的4 个新的苯丙素取代的黄烷-3-醇成分（puerins C～F）。4）N-乙基-2-吡咯烷酮黄烷醇成分[34]：例如从普洱茶中鉴定出来的8 个新的N-乙基-2-吡咯烷酮黄烷醇成分（puerins I～VIII）。这类化合物可能来源于儿茶素和茶氨酸的结合衍生物，有潜力作为黑茶质量控制和真假辨别的生化指标。

此外，应该注意的是，另一种代表性的黑茶——茯砖茶，该类黑茶在后发酵过程中的化学结构修饰主要是发生在B环[35-37]。例如，从茯砖茶中分离鉴定出的5 种黄烷醇的衍生物成分，其中包括茯茶素A和茯茶素B，该成分为黄烷醇的8-环裂变内酯化合物。产生这种化学结构修饰差异性的原因，可能主要与微生物的组成差异有关，一般认为普洱茶后发酵过程中的优势菌种为黑曲霉菌，而茯砖茶后发酵过程中的优势菌种为冠突散囊菌。普洱茶和茯砖茶两类黑茶，由于它们加工原料、渥堆发酵的微生物种类和加工工艺等方面的差异，研究发现它们的主要生化成分和生物活性也有较大区别[38]。

2.4 其他类型的分子修饰

其他类型的分子修饰可能是普洱茶后发酵过程中多酚类成分生物转化的一种次要方式或者补充方式。现有的研究也报道了普洱茶中多酚类成分的一些其他类型分子修饰的化合物成分，这些成分也有可能是普洱茶中重要的品质化学成分。例如，采用现代植物化学方法从普洱茶中分离纯化出的1 种重要的生物活性成分Teadenols A，研究发现它能促进脂肪连接蛋白的分泌以及抑制铬氨酸磷酸酶的表达，也具有较强的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基活性（半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为64.8 μg/mL）、清除超氧阴离子自由基活性（IC50＝3.335 mg/mL）以及较强的总氧化活性（IC50＝17.6 U/mL）；此外，晒青毛茶（或普洱生茶）中一般不存在Teadenol A成分，在后发酵过程中该成分逐渐累积；它在22 个普洱茶中的含量介于0.17～8.15 mg/g[39]。另外，日本最近也报道了一些新的酚性色素成分[40]等。

GA是普洱茶中特征性的酚性化合物，也是重要的酚性化合物之一。除了上述GA的甲基化修饰产物外，普洱茶中还鉴定出了其他的一些酚酸化合物的化学结构修饰产物。例如，2,5-二羟基-苯甲酸、2-羟基-苯甲酸、4-羟基-苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、1,3-苯二酚、4-甲基-1,2-苯二酚和1,2,4-苯三酚等化学成分[2]。在微生物活动的影响下，部分成分能够被生物转化为新的化学成分，例如3,4-二羟基苯甲酸可能是一种新的氨基化合物前体物质，N-（3,4-二羟基苯甲酰）-3,4-二氢苯甲酰胺（N-(3,4-dihydroxybenzoyl)-3,4-dihydrobenzamide）。

通过以上的分析可知，普洱茶后发酵过程中，在微生物分泌的胞外酶作用下，糖基化（或去糖基化）、甲基化以及其他类型取代方式的化学结构修饰可能是酚类成分生物转化的一些重要途径，以此形成了众多的多酚类成分的化学结构修饰产物。这些结构修饰产物对普洱茶的风味品质和生物活性产生重要影响，成为了普洱茶的重要品质化学成分和标志性成分，具有重要的研究价值。

3 多酚类成分化学结构修饰产物的生物活性变化

多酚类化合物的生物利用度比较低，其生物转化长期以来备受关注[41-44]。众所周知，茶叶中的多酚类化合物，例如儿茶素成分及其氧化聚合产物茶黄素、茶红素以及黑茶中大量形成的茶褐素等，生物利用度很低[45]，人们在努力尝试多种途径来有效提高其生物利用度。有研究表明，微生物参与的某些处理过程能在一定程度上显著提高涉茶产品或提取物组分的生物活性[46-47]。因此，有理由推断，黑茶后发酵过程中通过生物转化形成的一些多酚类化合物的化学结构修饰产物可能有比较强的生物活性或者较高的生物利用度。这一点目前已经得到了初步的验证[27]。

研究发现，酚性成分的糖基化、甲基化、酰基化等分子修饰反应，不仅增加了类黄酮物质的化学多样性，同时也改变了原有酚性化合物的物理化学性质，从而使其生物活性也发生了一定的改变。例如，糖基化或者去糖基化修饰，从化学角度上说，黄酮类的糖基化修饰能提高药效、溶解度、稳定性和药代动力学性质[48-49]。一般意义上说，微生物倾向于将黄酮成分转化成相应的3-O-配糖体和7-O-配糖体。对黄酮类化合物进行糖基化修饰已经成为获得新的高活性以及低毒衍生物的重要方法。黄酮的糖苷类成分与普洱茶的滋味与色泽品质密切相关，是茶汤的关键滋味成分和关键呈色成分。再如，酚性成分的甲基化修饰，是通过在酚性成分的羟基部位进行甲基化修饰而形成的一类分子后修饰化合物，由于羟自由基发生甲基化，致使此类衍生物不易与硫酸盐和葡萄糖醛酸结合，从而增加了在人体内的代谢稳定性；与此同时，甲基化也有利于增强酚类化合物的生物膜转运能力，从而提高了其口服利用率和部分生物学活性。甲氧基类黄酮较类黄酮而言，可能通过降低羟基发生氧化作用而带来的氧化胁迫，从而降低对细胞的毒副作用[50]。在羟基上进行甲基化是黄酮类物质的重要修饰反应，可以生成具有新的生物活性的甲氧基黄酮。例如，3’-O-甲基槲皮素具有较好的抗凝血活性[51]，而其另外两种甲基化衍生物3-O-甲基槲皮素和7-O-甲基槲皮素均有较好的抗炎活性[52]。

通过以上分析可见，普洱茶后发酵过程中多酚类成分发生的这些如上所述的糖基化（或去糖基化）修饰、甲基化修饰、主要发生在黄烷醇和黄酮醇A环上取代等方式的结构修饰等化学转化过程，可能直接促成了普洱茶中具有较高生物利用度的生物活性成分的形成，进而可以对普洱茶的保健功效产生重要影响。后续有必要挖掘后发酵过程中多酚类成分结构修饰形成的高活性成分。

4 多酚类成分结构修饰产物检测分析方法的研究进展

目前普洱茶中只有极少数的多酚类化合物的结构修饰产物通过传统的色谱纯化技术得以发现和报道，而绝大多数的修饰产物的化学组成、风味品质特征以及生物活性等现在仍然是未知的。

在该类化学成分的鉴定方面，因这些成分的含量较低，且可能存在稳定性差的问题，传统的色谱纯化技术暂时很难有较大的突破。随着现代科学技术的发展，先进的检测分析技术手段，例如超高效液相色谱-Q-TOF-MS（ultra-performance liquid chromatography-Q-TOF-MS，UPLC-Q-TOF-MS）和全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）等，已经在现代分析检测中展现出了很强的优势[53-54]，具有很大的潜力为解析普洱茶中多酚类成分化学结构修饰产物提供先进的技术支撑。例如，2011年，日本佐贺大学采用HPLC-Q-TOF-MS技术[55-56]，在黑茶中发现了一种普遍存在的多酚类成分的衍生物成分（Teadenols A和B），该成分是在微生物参与下形成的，是黑茶的一个特征性成分；他们认为HPLC-Q-TOF-MS技术十分适用于茶叶样品中多酚类成分衍生物成分的鉴定与分析。2016年的一项研究中，也曾采用传统的色谱分离纯化方式鉴定出Teadenols A成分[39]。

此外，在该类成分的生物活性分析方面，一些更具生物相关性的细胞抗氧化法[57]以及HPLC-自由基清除检测（radical scavenger detection，RSD）在线筛选体系等具有一定的优势[58]，在多酚类成分的结构修饰产物的后续分析中可能具有较好的应用潜力。目前已有采用HPLC-DPPH技术分析茶叶活性成分的研究报道[59-60]，后续研究中，如果该类成分的分离纯化存在较大的困难，可以首先考虑用HPLC-RSD在线筛选体系对其后行进行初步的评价，而后再根据具体情况选择某些活性强的化学成分进行重点研究。

5 结 语

普洱茶中多酚类成分的化学结构修饰产物具有十分重要的研究价值和研究意义。在未来研究中，这些成分的主要研究思路可能至少包括以下几个方面：采用传统的色谱方法继续鉴定重要的多酚类成分的化学结构修饰产物；采用UPLC-Q-TOF-MS和GC×GC-TOF-MS等分析技术手段解析普洱茶多酚类成分化学结构修饰产物；采用感官组学方法分析其风味品质特征；采用HPLC-RSD技术分析其生物活性；采用代谢组学等技术分析其形成机理；研发富含多酚类成分的化学结构修饰产物的深加工产品或保健食品。若将来条件成熟，可考虑将该类成分作为重要的生化指标之一，用来指导普洱茶的实际生产。