山楂叶四种不同提取部位指纹图谱和总黄酮含量的比较研究*

高 婧，李明臣，徐宝欣，李艳荣，潘海峰△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.承德市食品药品检验检测中心；3.河北省滦平县中医院）

基础医学

山楂叶四种不同提取部位指纹图谱和总黄酮含量的比较研究*

高 婧1、2，李明臣3，徐宝欣1，李艳荣1，潘海峰1△

（1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000；2.承德市食品药品检验检测中心；3.河北省滦平县中医院）

目的:通过建立高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱和测定总黄酮含量，比较分析山楂叶四种不同提取部位：山楂叶50%乙醇提取部位（A）、中国药典收录的山楂叶过大孔树脂后醇提取物(B)、山楂叶乙酸乙酯部位(C)、山楂叶正丁醇部位(D)。方法：采用HPLC法建立山楂叶指纹图谱，采用Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，乙腈-0.1%冰醋酸-四氢呋喃为流动相梯度洗脱，检测波长320nm，流速0.9ml/min，柱温30℃。总黄酮含量测定采用紫外分光光度法。结果：山楂叶四种提取物指纹图谱共有峰的种类和数量存在差异，C与其它三种提取物的差别最大；提取物B的总黄酮含量最高。结论：本研究可为山楂叶提取物的进一步开发利用奠定基础，也能为研究山楂叶不同提取部位药效学差异提供一定的参考。

山楂叶；指纹图谱；总黄酮；提取部位

山楂叶为蔷薇科植物山里红（Crataegus pinnatifida Bge.Var. major N. E. Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶，有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效。因多靶点的综合治疗作用及较低的毒副作用，山楂叶正逐渐被开发利用制成不同的山楂叶制剂。市售山楂叶制剂以山楂叶不同提取部位为原料，如山玫胶囊[1]和心安胶囊[2]以山楂叶50%乙醇提取部位为原料，益心酮片[1]以山楂叶乙酸乙酯部位（2010版中国药典以前）为原料。根据山楂叶的化学成分主要为三萜类和黄酮类两大类的特点[3]，本研究对山楂叶四种不同提取部位，50%乙醇提取部位（A）、中国药典收录的山楂叶过大孔树脂后醇提取物(B)、山楂叶乙酸乙酯部位(C)、山楂叶正丁醇部位(D)的HPLC对照指纹图谱和总黄酮含量进行了对比分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200 Series液相色谱仪、Agilent-8453紫外分光光度计（安捷伦科技有限公司），AG245电子分析天平(梅特勒-托利多)，KQ-700型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂 A，10批，由御室金丹药厂提供；B，10批，购于西安斯诺特生物技术有限公司。C、D，自制，各10批。绿原酸（批号110753-201415）、牡荆素鼠李糖苷（批号111668-200602）、金丝桃苷（批号111521-201507）、牡荆素（批号100081-200907），中国药品生物制品检定所，供含量测定用；牡荆素葡萄糖苷（批号151103），上海融禾医药科技有限公司；芦丁（批号100080-201409），中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯，Fisher科技有限公司；实验用水，哇哈哈纯净水；其它试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 指纹图谱的建立与分析

2.1.1 色谱条件：色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）-四氢呋喃（C），梯度洗脱，梯度程序见表1。检测波长320nm，流速0.9ml/min，柱温30℃，供试品溶液和对照品溶液进样量均为10μl。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸（S1）10.23mg、牡荆素葡萄糖苷（S2）10.59mg、牡荆素鼠李糖苷（S3）13.28mg、牡荆素（S4）10.01mg、芦丁（S5）10.11mg、金丝桃苷（S6）10.15mg，置同一100ml容量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释至刻度，过0.45μm微孔滤膜，作为对照品溶液。

2.1.3 山楂叶提取物C和D的制备：⑴C的制备：取山楂叶药材50g，加6倍量50%乙醇浸渍48h，渗漉，收集漉液，减压回收乙醇至相对密度为1.04（60℃）的清膏，加等量水稀释后，加1/6倍量石油醚（60℃～90℃），振摇，取水层，用0.7倍量乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，即得。⑵D的制备：取山楂叶药材30g，加5倍量50%乙醇加热回流提取2次，合并提取液，减压回收至无醇味，用3倍量水饱和的正丁醇振摇3次，合并正丁醇提取液，减压回收正丁醇并浓缩至干，即得。

2.1.4 供试品溶液的制备：精密称取山楂叶四种提取物0.1g，分别置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇溶液10ml，超声提取30min，滤过，作为供试品溶液。

2.1.5 指纹图谱的建立：将四种提取物各10批供试品溶液按2.1.1的色谱条件进样测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004A），将10批样品色谱峰数据以中位数法生成对照指纹图谱，并对共有峰进行标定，见附图：

附图 四种山楂叶提取物的对照指纹图谱和共有峰

2.2 测定总黄酮含量[1]按照《中国药典》2015年版山楂叶提取物项下的总黄酮含量测定方法，得标准曲线方程Y=0.01307X(r=0.9998)。总黄酮含量测定结果：B总黄酮含量最高，C次之；A和D的含量接近，比较低。见表2：

表2 四种提取物总黄酮含量测定结果

3 讨论

本研究分别建立了山楂叶四种提取物指纹图谱的共有模式，从对照指纹图谱可见四种提取物均含有S1-S6这6种主要成分。提取物A-D分别得到18个、18个、25个、20个共有峰，A和B共有峰的数目一样，但所含化学成分的种类稍有不同；D共有峰数目比A、B多2个；C对照指纹图谱相对于其它3种提取物图谱，共有峰数目、种类明显不同。本研究提示，山楂叶四种提取物化学成分的种类存在明显差异，药理作用可能不同，差异有待进一步研究。

本研究测定总黄酮含量采用的是传统紫外分光光度法，以芦丁为对照品，通过形成络合物显色来测定，这种方法虽然存在一定的局限性，但大部分黄酮类成分均可以被检出。比较四种提取物的总黄酮含量，提取物B的总黄酮含量远高于其它3种。很多研究已经证实了黄酮类成分的多种药理活性[4-6]，如抗血栓、调节脂代谢等。鉴于本研究发现的山楂叶四种提取物总黄酮含量明显不同，因此建议临床用药时考虑山楂叶总黄酮的含量。

总之，本研究建立的实验方法科学、准确，可为山楂叶提取物的进一步开发利用提供理论依据，也能为进一步的谱效学研究奠定基础。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.506，1023，32.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会，中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂(第三册)[M].北京：中华人民共和国卫生部药典委员会，1992.53.

[3]郝东方，杨芮平，周玉枝，等.山楂叶的化学成分[J].沈阳药科大学学报，2009，26(4)：282-284.

[4]庞文悦，王莲，张荣泉.山楂叶总黄酮生物活性研究近况进展[J].食品研究与开发，2014，35(17)：134-136.

[5]Arslan R, Bor Z, Bektas N, et al. Antithrombotic effects of ethanol extract of Crataegus orientalis in the carrageenan-induced mice tail thrombosis model[J]. Thromb Res, 2011, 127(3): 210-213.

[6]杨宇杰，林静，王春民，等.山楂叶总黄酮对大鼠高脂血症早期干预的实验研究[J].中草药，2008，39(12)：1848-1850.

COMPARATIVE STUDY ON FINGER-PRINT AND TOTAL FLAVONOIDS CONTENT IN FOUR DIFFERENT EXTRACTION PARTS OF HAWTHORN LEAVES

GAO Jing, LI Ming-chen, XU Bao-xin, et al

(Institute of Chinese Materia Medica/Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine,Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To comparatively analyze 4 different extraction parts (A.50% ethanol extract from hawthorn leaf,B.alcohol extract of hawthorn leaf after macroporous resin,C.ethyl acetate part of hawthorn leaf,D.n-butanol part of hawthorn leaf). of hawthorn leaves by establishing HPLC fi nger-print and detecting total flavonoids content.Methods:The fingerprint of hawthorn leaves was established by HPLC method using Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)chromatographic column, acetonitrile-0.1% acetic acid-tetrahydrofuran as mobile phase with gradient elution, detection wavelength 320nm, fl ow rate of 0.9ml/min, and the column temperature was 30℃. The total flavonoids content was detected by ultraviolet spectrophotometry.Results:The common peaks of 4 extraction parts of hawthorn leaves in types and numbers had differences; The differences between extract C and the other three extracts was the largest. The total fl avonoids content in extract B was the highest.Conclusions:This study can lay foundation for further development and utilization of hawthorn leaves extracts, and also can provide references for studying pharmacodynamic differences of different extraction parts of hawthorn leaves extracts.

Hawthorn leaves; Finger-print; Total flavonoids; Extraction parts

R284.1

A

1004-6879（2018）01-0001-03

* 河北省中医药管理局科研计划项目（2017216）

△ 通讯作者

2017-04-09）