盐酸芬戈莫德含量测定方法研究

■陈 冰彭 诚路海滨

（1.吉林农业科技学院，吉林省吉林市 132101；2.吉林大学，吉林长春130021）

芬戈莫德（fingolimod）是从冬虫夏草中提取的，将其中的有效成分多球壳菌素的手性中心去除，修饰侧链后合成的一种新型免疫抑制剂。近年来，人们对芬戈莫德的研究越来越多，由于其毒性小，作用机理独特，可用于饲料添加剂、建立动物模型等方面，具有广阔的研究价值和应用前景。但该药物的质量分析方法标准还尚不完善，因此本文对自制合成的盐酸芬戈莫德原料药建立了HPLC法进行质量检查的方法。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

盐酸芬戈莫德对照品（含量为99.7%，中国生物制品检定所）；盐酸芬戈莫德供试品，吉林大学药学院实验室自制；甲醇、乙腈为色谱级，其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；VWD型及DAD型检测器(美国安捷伦公司)；KQ-400型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA-225D型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

2 盐酸芬戈莫德含量测定分析方法建立

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的配制

取盐酸芬戈莫德的对照品约10 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，加流动相适量，振摇、超声使其溶解，用流动相稀释至刻度，微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液的配制

取盐酸芬戈莫德供试品适量，精密称定，按对照品溶液浓度配制成供试品溶液，加适量流动相振摇、超声使其溶解，微孔滤膜滤过，即得。

2.2 色谱条件确定

2.2.1 最大吸收波长的确定

取盐酸芬戈莫德对照品溶液0.5 ml，置5 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按紫外-可见分光光度法以相应试剂为空白，进入DAD型检测器，在200～400 nm波长范围内进行扫描。结果见图1。

图1 盐酸芬戈莫德对照品光谱扫描三维图

结果表明，对照品溶液在215 nm处有最大吸收峰，综合扫描结果，确定波长为215 nm。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent C18-SB柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器；流动相：高氯酸钠溶液（取高氯酸钠14 g，定容至1 000 ml，加入适量高氯酸使其pH值为2.8）∶甲醇∶乙腈=93∶3∶100；柱温：25 ℃；流速：1.5 ml/min；检测波长：215 nm。

2.2.3 系统适用性试验

在本色谱条件下，供试品溶液中盐酸芬戈莫德得到较好的分离，其色谱峰的保留时间与对照品一致，并且理论塔板数为2 000以上。结果见图2～图4。

图2 盐酸芬戈莫德对照品色谱图

图3 盐酸芬戈莫德供试品色谱图

图4 空白溶剂色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 检测限与定量限

取盐酸芬戈莫德对照品适量，用流动相稀释，以信噪比S/N=3进样，进样量为10 μl，计算检测限为1 ng，以信噪比S/N=10进样，进样量为10 μl，计算定量限2 ng。见图5～图6。

图5 检测限检测色谱图

图6 定量限检测色谱图

2.3.2 专属性考察

为考察盐酸芬戈莫德在生产工艺及贮藏过程中可能的降解产物和色谱条件的选择性，采用酸、碱、氧化、高温等手段对本品进行破坏性处理。盐酸芬戈莫德在酸破坏、碱破坏和高温破坏条件下产生一定降解，在氧化条件下较为稳定，所产生的降解产物在选定色谱条件下均可与主峰达到基线分离，方法专属性良好。

2.3.3 线性关系考察

取盐酸芬戈莫德对照品适量，配成1 mg/ml的贮存溶液，然后分别配制不同浓度为0.055 0、0.082 5、0.110 0、0.137 5、0.165 0 mg/ml的盐酸芬戈莫德对照品溶液5份，加流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取滤液，作为不同浓度对照品溶液；分别将不同浓度对照品溶液进样10 μl测定，记录峰面积，以对照品峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。结果见图7。

图7 盐酸芬戈莫德标准曲线

图7显示，盐酸芬戈莫德在0.055 0～0.165 0 mg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为Y=158 490 160X-51 837.4，r2=0.999 8。

2.3.4 精密度试验

取同一浓度对照品溶液，重复进样6次，进样量为10 μl，依法进行测定，记录峰面积，计算RSD值为0.11%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验

取同一批样品6份，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，记录峰面积，计算RSD为0.09%，表明含量测定重复性良好。

2.3.6 稳定性试验

在本试验条件下，取供试品溶液分别在室温放置0、2、4、6、8、12 h，依法进行含量测定，记录峰面积，供试品溶液在0～12 h内的测定结果的RSD为0.13%。说明在此时间范围内测定结果准确可靠。

2.3.7 回收率试验

取盐酸芬戈莫德9份，每3份分别按照标示量的80%、100%、120%比例精密加入盐酸芬戈莫德对照品，按照“2.1.2”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定。加入量、测得量及回收率试验结果见表1。

表1 回收率试验结果

结果表明，加样回收率的RSD值为1.37%，结果符合要求，方法的准确度好、可行。

2.3.8 耐用性试验

此项分别考察了流速相对值变化±20%、柱温变化±5℃、流动相pH值变化±0.2、流动相比例变化±5%进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。要求是主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离。测定结果见表2。

表2 耐用性试验结果

由结果可以看出，样品在柱温、流速、流动相pH值、流动相配比变化等条件改变下，主峰与杂质峰达到基线分离，分离度合格，拖尾因子均没有大于2.0，理论塔板数不低于2 000，均符合规定，从以上数据表明本方法的耐用性良好。

2.4 样品质量检查

按上述所建立的含量测定方法，对三批自制盐酸芬戈莫德原料进行质量检查，测定结果见表3。

表3 三批样品含量测定结果

由测定结果表明，三批自制盐酸芬戈莫德与对照品溶液主峰的保留时间一致，且原料药HPLC图谱呈单一对称主峰，按外标法以对称峰面积计算原料药的盐酸芬戈莫德含量均在99.0%以上，符合盐酸芬戈莫德含量在98.5%～101.5%的要求。

3 结论

本文对所建立含量测定的分析手段进行方法学验证考察，很有实际参考价值。盐酸芬戈莫德对照品溶液的DAD检测结果显示该物质在215 nm有最大吸收，并确定了色谱条件。在此条件下，供试品溶液中盐酸芬戈莫德得到较好的分离，其色谱峰的保留时间与对照品一致，并且理论塔板数为2 000以上；方法专属性良好；盐酸芬戈莫德在0.055 0～0.165 0 mg/ml范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，精密度RSD为0.11%，重复性RSD为0.09%，稳定性RSD为0.13%，加样回收率RSD为1.37%，表明此方法可行，样品耐受性良好。采用所建立的质量控制分析方法对三批自制样品进行质量检查，结果含量均在98.5%～101.5%，符合要求。结果证明所建立的方法完全可以用于本品的质量控制。