高效液相色谱法同时鉴别3种维生素K3类饲料添加剂

■任玉琴 吴望君 张晓丽

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州311199）

我国是维生素K3的生产大国，其生产总量已超过全球产量的一半。维生素K3具有凝血功能，在畜禽和水产饲料中被广泛使用，中国兽药典[1]、中国药典[2]均收载了亚硫酸氢钠甲萘醌，农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》[3]收录了3种维生素K3类饲料添加剂，即亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)和二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醌(MPB)。MSB、MNB和MPB均以甲萘醌为官能团，在侧链上与不同基团结合形成的衍生物。维生素K3在饲料中的留存率低，饲料加工、载体等影响产品在饲料中的稳定性，在畜禽饲喂中生物利用率也存在差异，其中MNB在饲料中最具稳定性，生物利用率最高，MPB次之，MSB最不稳定[4]。MSB、MNP和MPB具有类似的功能和外观，现行的质量标准方法中采用甲萘醌官能团和相应的衍生基团进行鉴别试验，如甲萘醌的沉淀反应、二氧化硫的气味鉴别及烟酰胺的薄层色谱法等，鉴别方法繁锁，专属性不强[5]，需用多种方法加以配套。本文建立了用高效液相色谱法同时鉴别3类维生素K3化合物，方法操作简便、专属性强，能有效甄别3类维生素K3。

1 材料和试剂

亚硫酸氢钠甲萘醌，批号：11203112、11203203、12070701；亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌，批号：13052902、13081204、13081302；二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醌，批号：10122701、11052905、11052806；均来源于兄弟科技有限公司。

甲萘醌对照品：由中国兽医药品监察所提供，批号V0011003，含量为99.3%。

2 仪器和设备

Angliln1100高效液相色谱仪，带DAD检测器；Waters 2690高效液相色谱仪，带UV检测器；北京普析通用公司，TU-1910紫外-可见分光光度计。

3 高效液相色谱法方法的建立

3.1 检测波长的筛选

取上述三种产品适量，加水溶解，按照紫外分光光度法，在200～400 nm进行扫描，结果三种产品在230 nm处均有最大吸收，在265 nm处有次吸收（见图1），拟用230 nm作为检测波长。

3.2 色谱条件的建立

GB/T 26442—2010[6]亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌标准中用液相色谱方法测定含量，按该方法对 MSB、MPB和MNB进行测定，结果MPB和MNB均出现2个保留时间相同的主峰，见图2～图3，其中1个主峰保留时间同MSB主峰，该方法无法区分MNB和MPB。烟酰胺、二甲基嘧啶醇以共价键的形式与亚硫酸氢甲萘醌结合，极性较强的基团在普通的ODS C18柱上较难保留与分离，因此选用Waters Atlantis®HILIC Silica色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈/水（80∶20）为流动相，230 nm为检测波长，流速1 ml/min，进样量20 μl。

图1 MSB、MPB、MNB紫外吸收光谱图

图2 MPB色谱图

图3 MNB色谱图

3.3 测定

取样品适量，用水分别溶解稀释成0.04 mg/ml的上机溶液，用高效液相色谱仪上机测定，结果MNB和MPB溶液在色谱中均分离成两种组分，分别为与MSB主峰保留时间一致的亚硫酸氢甲萘醌色谱峰和二甲基嘧啶醇、烟酰胺组分色谱峰，MSB、MPB、MNB在该色谱条件下得到较好的分离，亚硫酸氢甲萘醌、烟酰胺和二甲基嘧啶醇色谱峰的分离度R≥1.9。见图4～图7。

3.4 色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比的考察

由于MPB、MNB在色谱中均有2个主峰，鉴于目前国内还没有标准物质提供，为此用相对保留时间和相对峰面积比对MPB、MNB产品进一步考察，并用不同仪器、不同时间和小幅改变流动相比例，考察方法的耐用性。

图4 MSB液相色谱图

图5 MNB液相色谱

图6 MPB液相色谱图

图7 MSB、MPB、MNB重叠色谱图

色谱条件：流动相：乙腈/水（90∶10），色谱柱：Waters Atlantis®HILIC Silica（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速：1 ml/min，检测波长：230 nm。

取试样适量，用水溶解稀释成浓度约为0.04 mg/ml溶液，用不同品牌的2台仪器上机测定。结果见表1。

表1 MSN、MPB、MNB检测结果

上述测定结果显示，用不同仪器和时间重复实验，两个主成分峰相对保留时间MPB均为0.19，MNB为 0.30～0.32；峰面积比值 MPB 分别为 2.49～2.70、2.99～3.04；MNB为2.98～3.03、2.79～3.21，在该色谱条件下，组分的相对保留时间有较好的重现性，但组分峰面积比值范围有交叉。

4 讨论和结论

亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)和二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醌（MPB）均未在USP[7]、BP[8]和EP[9]标准收载。MSB和MNB分别以 GB/T 7294—2009[10]、GB/T 26442—2010国家标准颁布。在含量测定中，MSB以甲萘醌为测定目标，通过分子量换算计算MSB含量；MNB用液相色谱外标法测定烟酰胺和亚硫酸甲萘醌含量，方法准确性好，但该色谱条件无专属性，MPB和MNB均呈现保留时间相同的2个色谱峰，因此产品的鉴别尤为重要。MSB的鉴别试验包括以甲萘醌官能团的化学反应与熔点鉴别及用二氧化硫气体鉴别亚硫酸根；MNB的鉴别试验也包括甲萘醌官能团的化学反应鉴别、熔点鉴别及用薄层色谱法鉴别烟酰胺，需用相应的配套试验完成产品鉴别，产品间鉴别有交叉，专属性不够。本文研究建立的鉴别方法，有效解决了上述问题，该色谱方法，用保留时间或相对保留时间就能有效鉴别3种维生素K3类化合物，方法简单，重现性好。