高通量测序研究膨化秸秆生物发酵饲料对辽育白牛肠道菌群的影响

■杨淑华陈 帅,2李 鹏 龙 淼 李 林佟 翠张诗萌何剑斌*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866；2.辽宁省爱普罗斯饲料有限公司,辽宁 沈阳 110164)

反刍动物具有复杂的胃肠道环境，而且处于平稳状态，一旦出现营养水平的改变、疾病、应激等因素，微生物菌群会出现变化，并直接影响着动物的机体状况。而膨化秸秆生物发酵饲料通过外源加入的肠道有益菌，更能有效调节肠道菌群的平衡，为机体健康提供一个有效的保证。肠道是动物机体营养物质消化和吸收的主要场所，胃内没有充分消化的食物，会进入肠道完成二次消化，为机体充分地利用营养物质提供保障。肠道内丰富的营养物质可以提供微生物生长繁殖所需的营养，同时通过协同作用，可以有效分解利用不易消化的粗纤维饲料。

Orin C.Shanks等（2011）从6个不同的牛群，每个牛群选取5头健康的牛，被平均分配到3个处理组，1组：饲粮中粗饲料的比例达80%；2组：饲粮中粗饲料比例达75%；3组：饲粮中的颗粒玉米比例达75%，饲喂90 d后，采集直肠粪便进行菌群分析，发现细菌群落主要属于硬壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，而在不同门分类水平上，由于饲粮精粗比不同，不同菌属也存在较大的差异。G.J.Lascano等（2013）将体重相近的8头荷斯坦奶牛，随机分成两个处理组，饲粮中粗纤维高低水平不同，结果发现：粗纤维较高的处理组，粪便中的纤维分解菌属、丁酸弧菌属的数量明显增加，而细菌总量也照常规饲喂高出近50%。以往研究发现，饲喂膨化秸秆生物发酵饲料可促进肉牛的生长，提高饲料转化效率，可替代部分精料（崔树和，2015），然而其具体机制尚不清楚。本试验通过在辽育白牛饲料中添加不同比例的膨化秸秆发酵饲料，采用高通量测序技术对辽育白牛直肠粪便的菌群进行分析，以探究膨化秸秆生物发酵饲料对辽育白牛肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组与饲养管理

选择健康无疾病的辽育白牛40头体重相近[（300～350）kg]组建试验牛群。将试验牛按照随机分组的原则，分为4组，每组10个重复，经方差检验，各组间初始体重差异不显著（P＞0.05）。试验前所有试验牛用伊维菌素进行驱虫，大黄苏打粉健胃。

试验时间为2016年5月～2016年11月，试验全期为160 d，其中预试期30 d，正试期130 d。试验地点为辽宁省阜新市彰武长青牧业，试验牛采用散养育肥模式，定期消毒，每天5：00和17：00饲喂，牛群采用自由饮水。每天按时观察牛群的健康状况，对特殊情况及时处理，免疫按照牛场以前程序执行。

1.2 试验处理与组别

试验分为4组，对照组（100%基础精料+黄贮饲料）、试验1组（80%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）、试验2组（70%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）、试验3组（60%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料）。其中100%精料即按体重的1.2%给予精料。

1.3 试验日粮组成

膨化秸秆生物发酵饲料由辽宁省阜新市祥和牧业提供。4个组采用相同的精料日粮配方，在试验过程中为避免瘤胃酸中毒，适当随黄贮饲料、膨化秸秆饲料添加量的增多，逐渐增加小苏打的量，日粮组成水平见表1。

表1 日粮组成（%）

1.4 试验主要试剂及试验仪器

主要试剂：E.Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA公司)，Qubit2.0 DNA检测试剂盒(Life公司)，Taq DNA Polymerase(Thermo公司)，Agencourt AMPure XP（Beckman公司）。

主要仪器：Qubit®2.0荧光计(Invitrogen Q32866)，凝胶成像系统(美国UVP)，PCR 仪(Eppendorf，T100TMThermal Cyeler)，电泳仪电源（北京市六一仪器厂，DYY-6C型），台式离心机（Thermo Fisher，Pico-21）。

1.5 样品采集

试验结束后，每组随机选取3头辽育白牛，无菌直肠取粪，放入5 ml冻存管内，在液氮罐内冻存，迅速带回实验室，置于-80℃超低温冰箱中，用于粪便菌群的分析。

1.6 提取DNA及测序

提取DNA的步骤参照基因组DNA抽提试剂盒(OMEGA公司)的使用说明书完成。利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应应加入的DNA量。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的V4-V5通用引物，对样品进行PCR扩增及测序。针对16S rRNA基因V4～V5区，合成带有barcode的特异引物。利用 515F（5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3’）909R（5’-AGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3’）两种引物进行PCR扩增。通过barcode区分样品序列，将各样本序列进行质量控制过滤后，对样品进行Alpha多样性分析及菌群构成分析。Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包括丰富度指数（Chao1/Ace指数）、多样性指数（Simpson/Shannon指数）等。

1.7 数据分析

数据采用SPSS 21.0软件处理，进行单因素方差分析，P＜0.05显著性差异，具有统计学意义。

2 试验结果

2.1 菌群组成分析

为得到每个操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）对应的物种分类信息,首先需要对OTU进行物种分类，其次通过RDP和Blast两种方法，参照物种分类数据库，将细菌进行门、科、属水平的分类。

2.1.1 门水平菌群组成

粪便样本经高通量生物学信息分析，共得到15个菌门，相对丰度大于1%的门类见表2，其余相对丰度低于1%的门类见图1。经分析可以得出：拟杆菌门、厚壁菌门为粪便细菌中的优势菌门，添加膨化秸秆生物发酵饲料的3个试验组中厚壁菌门、螺旋体门的相对丰度都有所提高，拟杆菌门相对丰度有所下降。其中试验2组中厚壁菌门、螺旋体门的相对丰度显著高于其他三个组，且差异显著（P＜0.05），拟杆菌门相对丰度显著低于对照组、试验3组且差异显著（P＜0.05）。

表2 粪便门水平菌群组成（%）

图1 粪便细菌门水平菌群组成

2.1.2 属水平菌群组成

粪便样本经过分类共得到49个属，剩下的记为other。表3是粪便细菌属水平主要的物种组成，其余的丰度较低的见图2。经分析得出：孢杆菌属为粪便细菌中的优势菌属，对照组孢杆菌属相对丰度高于3个试验组，但差异不显著(P＞0.05),帕拉普氏菌属相对丰度高于3个试验组，差异显著(P＜0.05)。3个试验组的拟杆菌属、颤杆菌克相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)，试验2组梭菌属IV相对丰度显著高于对照组、试验3组(P＜0.05)，试验1组拟普雷沃氏菌属相对丰度显著高于其他3组(P＜0.05)。

表3 粪便细菌属水平主要菌群组成(%)

图2 粪便细菌属水平菌群组成

2.2 Alpha多样性分析

利用Mothur软件对每个样品的OTU数量（相似水平97%以上）进行计算，OTU数量可以代表样品物种的丰度（Zhang M L，2009）。由表4可知，在所有样品中，试验4样品OTU数量最多，对照组最少，这表明试验组牛粪便中菌群的丰度很高，并且各试验组与对照组间的菌群丰度存在较大差异。

对单样本进行微生物多样性(Alpha)分析，可以反映微生物群落的丰度和多样性，运用一系列统计学分析指数来估计样本中的物种丰度和多样性。由表4可以看出：对照组、试验1组、试验2组、试验3组的粪便样本中的微生物辛普森指数差异不显著(P＞0.05)。试验1组、试验2组，试验3组的粪便样本中的香浓指数、艾斯指数、赵氏指数差异不显著(P＞0.05)。对照组和试验1组、试验2组的粪便样本中的香浓指数、艾斯指数、赵氏指数差异显著(P＜0.05)，对照组和试验3组粪便样本中的香浓指数、艾斯指数、赵氏指数差异不显著(P＞0.05)。

表4 粪便多样性指数统计

3 讨论

肠道中微生物的变化与粪便菌群的构成正相关，因此对粪便菌群多样性的研究可以帮助人们深入研究肠道菌群的变化（王丽凤，2014）。近年来，在各研究领域中更多地采用分子生物技术来对微生物群落进行分析，其中主要方法有聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、荧光原位杂交、变性梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性技术、构建克隆文库等（李袁飞，2015；Fifuerola，2007）。比较而言，高通量测序技术对微生物群落结构的研究具有准确定量、实时检测等优势(Li，2010；Tang，2012)。曾燕（2015）对成年健康绵羊肠道内的微生物进行高通量测序发现，肠道内的细菌主要来源于11个门的菌群，其中厚壁菌门占(44.37%)、拟杆菌门占(38.73%)，表明厚壁菌门和拟杆菌门为成年健康绵羊肠道内的优势菌群。Shanks(2011)采集健康肉牛的粪便进行宏基因组测序，虽然饲喂的条件不同，但主要微生物群落都属于厚壁菌门和拟杆菌门。杨伟平（2015）采用DGGE方法研究藏猪肠道中细菌群落组成，拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌门，采用高通量测序技术研究细菌肠道中细菌的多样性发现，拟杆菌门厚壁菌门为最丰富的细菌群类。本试验在辽育白牛日粮中添加不同比例的膨化秸秆生物发酵饲料，取直肠内粪便，对肠道菌群进行宏基因组测序，发现在门水平上，直肠中的优势菌群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，这与以往国内外研究基本一致。

试验动物不同，在属的水平上存在种属差异。朱岩丽（2013）用一定纤维水平的粗日粮饲喂家兔，发现直肠中优势菌属为孢杆菌属、瘤胃球菌属。王鹏（2015）在育肥猪日粮中添加膨化秸秆生物发酵饲料，发现瘤胃球菌属、琥珀酸弧菌属等纤维素分解菌属随着膨化秸秆生物发酵饲料添加量的增加而增加，增加的纤维素分解菌属与本试验结果有部分不同。本试验检测发现，孢杆菌属、拟杆菌属为辽育白牛粪便的优势菌属，孢杆菌属具有一定的纤维素分解能力，拟杆菌属具有消化碳水化合物的作用。添加膨化秸秆生物发酵饲料量的3个试验组，孢杆菌属、颤杆菌克、产琥珀酸菌、梭菌属IV等纤维分解菌属的相对丰度均提高。可能由于动物品种不同，肠道菌群结构不同，但大体结果一致，都是纤维素分解菌有所增加。梭菌属IV、梭菌属XlVa是肠道中重要的丁酸产生菌，与动物的生长有密不可分的关系，添加膨化秸秆生物发酵饲料的三个试验组中丁酸产生菌都有明显增加。丁酸产生菌的发酵产物丁酸可以为机体提供一部分能量，保持肠道稳态，具有抗癌症的功效。以上结果说明，膨化秸秆生物发酵饲料会提高辽育白牛肠道内纤维素分解菌、蛋白质降解菌、丁酸产生菌等功能菌的数量，有利于机体更好地完成对粗纤维、粗蛋白的消化吸收，同时使肠道内的菌群结构保持稳定。

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，常用的度量指标有赵氏指数（Chao1 index）、香农指数（Shannon index）、辛普森指数（Simpson index）和艾斯指数（Ace index）等。计算菌群丰度采用赵氏指数和艾斯指数，艾斯指数用来估计群落中含有OTU数目的指数，是生态学中估计物种总数的常用指数之一；计算菌群多样性采用香农指数和辛普森指数，辛普森指数指数值越大说明群落多样性越高，香农指数越大说明群落多样性越高。王鹏（2015）在育肥猪日粮中添加膨化秸秆生物发酵饲料，通过PCR-DGGE和高通量测序检测猪直肠内的微生物状况，发现试验组猪肠道微生物的香浓指数、赵氏指数增加，表明试验猪肠道内微生物的多样性提高。尹鹏鹏（2012）在肉鸭日粮中添加富含乳酸菌的发酵饲料，经过PCR-DGGE检测回肠菌群多样性，发现添加益生菌组条带数比对照组显著提高，说明添加益生菌发酵饲料可以较好地保护肠道内微生物的多样性，但要注意添加量不要过量。本试验对辽育白牛粪便中菌群进行Alpha多样性比较，发现试验组的香浓指数、艾斯指数、赵氏指数较对照组增加，表明肠道内微生物多样性提高。试验组辽育白牛粪便内微生物总数较对照组多，微生物多样性增加。试验2组（70%基础精料+膨化秸秆生物发酵饲料饲喂）辽育白牛肠道菌群结构较试验1、3组好、菌群多样性增加。表明，肉牛日粮内添加适量的膨化秸秆生物发酵饲料可改善肠道菌群的多样性，有利于肉牛生产性能的提高。