从湖北青砖茶渥堆过程中分离真菌总状枝毛霉菌的鉴定与模拟发酵研究

王春燕，肖长义,2*，李世刚,2，涂璇，何建刚

1. 湖北长盛川青砖茶研究所，湖北 宜昌 443000；2. 三峡大学医学院药学系，湖北 宜昌443002；3. 三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443002

湖北青砖茶是一种黑茶，以晒青毛茶为原料，经过渥堆发酵、陈化、蒸压、烘干等工序精制而成的后发酵茶。根据前人的研究可知，青砖茶品质形成的关键是渥堆发酵工序，在发酵过程中，以微生物的活动为中心，以毛茶为基质，在湿热条件多种微生物的共同作用下，茶叶内含成分发生系列氧化、缩合、降解、聚合反应，从而形成青砖茶独特的红黄汤色，陈香，醇和滋味等品质特征[1]。但是由于青砖茶产业结构封闭，基础研究相对滞后，青砖茶的发酵机理仍然未能完全明了，生产方式仍然延续传统方法，产业升级仍然没能实现重大突破，茶砖品质稳定性和安全性仍然难以得到有效保障。

为此，本试验拟对取自渥堆发酵茶堆中的真菌进行分离、鉴定，以期探明参与发酵的真菌的种类及其种属特征，为探究真菌在茶堆发酵过程中的具体作用奠定基础，为进一步利用真菌用于青砖茶生产提供基础保障。

1 材料与方法

1.1 发酵茶叶

采集鑫鼎生物科技有限公司青砖茶发酵堆，选取良好的渥堆中布满菌丝的茶叶，用于分离菌株。

1.2 培养基与试剂

马铃薯葡萄糖培养基，查氏琼脂培养基，查氏酵母琼脂培养基，麦芽汁葡萄糖培养基（青岛海博生物技术有限公司）。核酸抽提试剂盒、核酸染色[生工生物工程（上海）股份有限公司]，琼脂糖凝胶。

1.3 菌株分离纯化

取发酵堆茶叶少许于300 mL无菌水中振荡，取悬液配成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各 10 mL，取 10-3、10-4、10-53 个梯度各 0.1 mL用PDA培养基涂布平板，超净台上吹干，将平板置于25℃培养7 d，每个梯度重复3次，挑取不同类型的真菌单菌落于PDA平板上进一步纯化培养，对分离得到的菌株分别命名为LC-1，LC-2，LC-3等。本试验选取 LC-2进行下一步研究。

1.4 真菌的形态学鉴定

1.4.1 菌落特征

参照《中国真菌志》中对真菌形态描述办法，将菌株LC-2分别接种于查氏琼脂、查氏酵母琼脂和麦芽汁培养基上培养观察，并且分别放置于25℃、28℃、37℃环境中培养3 d，分别观察菌株的生长情况。生长情况描述包括菌落直径、颜色、菌落形状等[2]。

1.4.2 菌株显微形态观察

菌株LC-2在PDA平板上培养，用接种环挑取少量菌体，置载玻片的水滴中，乳酸棉兰染色，加盖盖玻片，于光学显微镜下观察。参照《真菌鉴定手册》《真菌的形态和分类》进行形态比对[3-4]。

1.4.3 扫描电镜形态学观察

取生长良好菌落的菌体，置 2.5%戊二醛中进行固定，24 h后置换入70%乙醇中备检。将保存的菌体置于铜载物台上，在干燥箱中60℃烘干，置于真空镀膜仪中镀膜，用JSM-7401F冷场发射扫描电子显微镜进行观察，照相。

1.4.4 菌体培养与DNA提取

将保存在 PDA固体培养基上的菌株 LC-2转接到PDA液态培养基中，于28℃ 180 r·min-1培养 3 d，过滤后收集菌丝。用核酸抽提试剂盒提取菌株DNA，并于1.0%的琼脂糖凝胶上检测DNA的质量与浓度。获得的基因组序列放置于-20℃冰箱保存[5]。

1.5 真菌的分子生物学鉴定

1.5.1 ITS序列扩增测序与分析

基于 ITS序列的系统发育分析方法一直被广泛应用于真菌鉴定[6-8]，本试验菌株LC-2的系统发育分析借鉴于此。利用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增nrDNA ITS区域。ITS序列扩增引物为 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′； ITS4 ：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由华大基因公司合成。PCR扩增反应体系含DNA模板 0.5 µL、10×Taq 酶缓冲液 2.5 µL、5 mol·L-1dNTP 2 µL、ITS1 和 ITS4 引物各 2 µL、EX Taq酶 0.5 µL，加 ddH2O至 25 µL。扩增反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，进行 30个循环，最后72℃延伸10 min。取2 µL扩增产物电泳检查扩增结果。

PCR产物纯化后送华大基因测序，每个扩增条带均进行正、反向测定。将两端序列进行拼接和手动矫正后，在NCBI上进行同源性比对。

1.5.2 LSUrDNA序列扩增测序与分析

菌株LC-2基于LSUrDNA序列的系统发育分析方法参照苏经迁等的方法[9]。利用真菌通用引物 NL1和 NL4进行 PCR扩增 28 S nrDNA D1区域。LSUrDNA序列扩增引物为NL1：5′-GCATATCAATAAGCGG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。引物合成、PCR扩增与测定方式均与 ITS序列测定与分析方法一致。

1.5.3 真菌同源性比较、遗传进化分析与系统发育树的绘制

以菌株ITS序列和LSUrDNA扩增序列为目的序列，在GeneBank中用BLAST程序搜索同源序列，挑选与菌株序列相近的参考序列分别构建系统发育树。运用 MEGA 5.0中的ClustalW程序对所选序列进行排列，并用邻接法（NJ）对排列结果构建系统聚类树，进行遗传进化分析。将真菌ITS序列提交到NCBI数据库中，获得GenBank登录号。

1.6 小鼠急性毒理试验

根据《食品安全国家标准 急性经口毒性试验》中限量法对菌株LC-2的毒性进行检测，取清洁级昆明小鼠40只（由三峡大学动物中心提供），体重18～22 g，雌雄各半，分为两组。将菌株LC-2培养物制成冻干粉，用超纯水制成合适浓度并灭活，按 10 g·kg-1的剂量给小鼠灌胃，对照组灌入水，以口腔灌胃形式一次性给予每只 1 mL，饲养 14 d，其间对小鼠进行活体观察，14 d后进行眼球取血，制血涂片，wight端特化染色后镜检。脱颈处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾5脏器于甲醛中固定，石蜡包埋，切片，HE染色后镜检。

1.7 固态模拟发酵试验

取 5 kg四级晒青毛茶原料，洒水至含水量达 35%，人工接种菌株 LC-2，接种量为每公斤茶接种20万个真菌孢子，发酵环境温度设置为 28℃，湿度 90%，发酵时间 11 d。发酵期间每天检测茶样温度，香气和颜色变化情况。于发酵过程中，取茶叶表面包裹的菌体，置载玻片以乳酸棉兰染色，加盖玻片，放于光学显微镜下观察，鉴定菌株类型。发酵结束后，取茶样与用传统方式发酵生产的青砖茶进行感官审评，对比不同发酵方式制作的青砖茶品质差异。

2 结果与分析

2.1 菌落形态鉴定

真菌菌株LC-2在查氏琼脂（CA）平板上培养5 d，25℃环境下，直径约17 mm，菌落正反面均为白色，色浅，质地绒状；28℃环境下，直径约20 mm，菌落色浅，呈白色，有绒状气生菌丝；37℃环境下，菌株不生长，图1显示菌株生长第3天状态。

菌株LC-2在查氏酵母琼脂（CYA）平板上培养5 d，25℃环境下，直径约61 mm，菌落正反面均为白色，质地绒状；28℃环境下，直径约56 mm，菌落正反均呈白色，具大量绒状气生菌丝；37℃环境下，菌株不生长，图2显示菌株生长第3天状态。

菌株LC-2在麦芽汁琼脂（MEA）上培养5 d，25℃环境下，直径约 22 mm，菌落正反面均为白色，具大量绒状气生菌丝；28℃环境下，直径约14 mm，菌落色浅，呈白色，无绒状气生菌丝；37℃环境下，菌株不生长[2]，图3显示菌株生长第3天状态。

图1 菌株LC-2在查氏琼脂培养基上分别置于不同温度环境中的生长情况（3d）Fig. 1 The colony growth of strain LC-2 on Czapek agar at different temperature for 3 days

2.2 光镜下形态鉴定

菌株 LC-2形态结构如图4，菌丛较矮，绒状，菌丝细且软弱，幼菌丛白色，菌苔先呈白色后变为灰色或黄褐色至褐色，37℃下几乎不生长。

菌体丝状有隔膜，每个隔断中有一个核，无假根，气生菌丝中含大量形成厚垣孢子，无性阶段的孢子为不动的孢囊孢子或与分生孢子相似的孢子囊，孢子囊出现很早，内含孢子数量少，随着孢子囊生长，孢囊孢子逐渐增多，孢囊体积也随之增大。孢子囊呈球状，壁薄易破裂，孢囊孢子由孢子囊壁破裂后释放出来，孢囊孢子呈球形，光滑，数量大。孢囊孢子释放后，可见囊轴，无囊托，囊轴球形至卵圆形，孢子囊中无轴基。孢囊梗呈单轴状分枝，分枝不规则，分枝顶端着球形孢子囊。无匍匐菌丝生出，所生孢子囊不做分枝拳曲，无分枝的手指状凸起。未观察到结合孢子，不形成子实体。

参考《真菌鉴定手册》与分子鉴定结果，初步将菌株 LC-2鉴定为毛霉属（Mucor racemosus）菌株，命名为毛霉菌 LC-2菌株[3-4]。

2.3 扫描电镜下形态鉴定

菌丝菌体全部呈倒伏状。由于脱水的原因，全部菌丝和孢子梗均呈扁薄的条带状，条带菲薄，条带的宽窄差异大，约5～20 µm。成熟的孢子囊大，呈球形。囊壁外表面不光滑，有密集排列的带基座的棘刺样突起，大小均匀，刺长约 0.5 µm。当孢子囊成熟破裂释放出孢子时，囊壁外表面的棘刺样突起会发生脱落。孢子囊壁十分菲薄，内壁表面光滑，分生孢子呈球形；表面光滑，直径约 5～6 µm。由于失水的原因，孢子全部呈皱缩干瘪状态。孢子梗在

图2 菌株LC-2在查氏酵母琼脂培养基上分别置于不同温度环境中的生长情况（3d）Fig. 2 The colony growth of strain LC-2 on Czapek yeast extract agar at different temperature for 3 days

图3 菌株LC-2在麦芽汁培养基上分别置于不同温度环境中的生长情况（3 d）Fig. 3 The colony growth of strain LC-2 on Malt extract agar at different temperature for 3 days

图4 菌株LC-2光镜观察图像Fig. 4 The images of strain LC-2 by light microscopic examination

图5 菌株LC-2扫描电镜观察图像Fig. 5 The electron microscope images of strain LC-2

孢囊接近成熟时期，表面也有许多颗粒样突起，显得十分粗糙，待孢囊释放出孢子后，表面会变得光滑，呈树皮样条纹。菌丝呈苇杆样，表面光滑，很少刺样突起（图5）。

2.4 分子鉴定结果

PCR扩增获得ITS片段和LSUrDNA片段（图6），纯化后进行测序，测得两基因片段大小分别为659 bp和566 bp，同源性比对结果分别如下：菌株 ITS序列与毛霉属总状枝毛霉（Mucor racemosus）和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、毛霉菌（Mucor plumbeus）、刺囊毛霉（Mucor spinosus）具有最高同源性，达99%。

菌株LSUrDNA序列与毛霉属总状枝毛霉（Mucor racemosus）和根毛霉（Rhizomucor racemosus）同源性最高，达100%；与毛霉菌（Mucor plumbeus）、刺状毛霉菌（Mucor spinosus）同源性达99%。

构建的系统发育树表明（图7和图8），菌株 ITS序列与总状枝毛霉菌和卷枝毛霉在同一分枝上，LSUrDNA片段与总状枝毛霉在同一分枝，自检支持率达90%，表明菌株LC-2与总状枝毛霉菌遗传距离最近。

2.5 急性毒理结果

试验结束时小鼠未见死亡，试验期间，小鼠的体重、营养状况，精神状态及活动与正常对照组相比未见任何异常。解剖观察，小鼠各脏器均未见肿大或其他明显病变，各脏器切片经HE染色后于显微镜下观察，均未发现任何病变情况。血液涂片检测未见血细胞形态及白细胞分类计数异常。

图6 菌株LC-2 ITS序列和LSUrDNA序列电泳图Fig. 6 Agarose electrophoresis of ITS and LSUrDNA sequences from strain LC-2

图7 基于菌株LC-2 ITS序列构建的NJ树Fig. 7 Phylogenetic tree of the ITS sequences of strain LC-2 and other species using NJ method

图8 基于菌株LC-2 LSUrDNA序列构建的NJ树Fig. 8 Phylogenetic tree of the LSUrDNA sequences of strain LC-2 and other species using NJ method

表1 用菌株LC-2发酵茶与传统青砖茶感官审评结果Table 1 Sensory comparison of traditional green brick tea and the simulate fermentation tea with strain LC-2

2.6 固态模拟发酵结果

选用4级毛茶为材料，参照青砖茶自然发酵过程进行模拟发酵试验。发酵过程中可见茶样由墨绿色逐渐变暗变褐，香气由青气逐渐转化为酵香，后略有酸辛味，最终为醇香带甜香。翻堆发现，茶堆表面各底部有大量白色菌丝包裹茶叶，并有褐色茶汁溢出，于茶叶上呈水珠状。在发酵过程中对茶叶表面白色菌体进行光学显微镜下鉴定，其形态与所接种的菌株形态一致，为LC-2菌株。

对利用毛霉菌菌株LC-2发酵茶与传统发酵青砖茶的品质进行对比评价，感官分析结果表明：人工接种真菌LC-2固态发酵生产的青砖茶与传统方法生产的青砖茶相比，汤色红黄明亮、香气甜香，滋味甜醇较浓，感官品质特点与传统产品接近（表1）。

3 讨论

同一菌株在不同培养环境中，由于培养基营养成分各异，培养物的形态特征及生理生化特点会有所不同[10]。本研究依据齐祖同[2]的分析鉴定方法，通过在查氏琼脂（CA）、查氏酵母（CYA）和麦芽汁琼脂（MEA）培养基上，对毛霉菌LC-2进行培养鉴定，真菌LC-2在3种培养基上都能够生长，菌株形态与总状枝毛霉菌（Mucor racemosus）最为相似。结合ITS序列和 LSUrDNA序列共同比对结果，菌株LC-2的 ITS序列与总状枝毛霉（Mucorracemosus）同源性为 99%，LSUrDNA序列与总状枝毛霉（Mucor racemosus）高达100%，因此，该菌株被认定为总状枝毛霉菌。本研究从菌种形态和分子鉴定方面对菌株进行了描述和鉴定，接下来还会探索菌株的生理生化特征，检测菌株的特征指纹图谱，为后续菌株的工业应用打下基础。

菌株LC-2已经完成了在NCBI网站上的基因注册，注册编号为KY37220.1，菌株送往中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，保藏编号为M2017241。本研究从青砖茶分离出总状枝毛霉菌，并提交该菌株基因序列，丰富了该菌株生长来源和应用途径。

在不同环境下培养菌株的结果显示，毛霉菌LC-2最适宜的培养基质为查氏酵母琼脂，环境温度为25℃。在28℃培养环境中，菌株LC-2生长受到影响，在37℃环境中不生长，说明该菌株不耐高温。因此，在传统发酵过程中，该菌株不会在堆温较高的中心持续发挥作用。应该在发酵起始阶段，该菌株分布在茶堆靠近中心的起始位置，以后随着堆温升高，逐渐向茶堆外部转移，在发酵中后期主要分布在茶堆表面和底部，这与模拟发酵所观察到的现象一致。在该真菌分布茶堆区域中茶叶色泽转化明显，是否该菌富集区域茶叶色泽转化更加充分，需要进一步研究确认，该菌株在茶堆发酵过程中的具体作用也需要进一步研究确认。

对分离得到的菌株进行生物安全性测试，综合小鼠在试验期间的行为、脏器切片观察结果，菌株LC-2冻干粉对小鼠没有危害作用。说明该菌株具有良好的生物安全性，可以利用该菌株进行青砖茶的安全生产。

黑茶发酵过程离不开微生物的参与[11-14]，我们用平板梯度稀释法分离也获得了 LC-1、LC-3等菌株，印证了前期其他学者的相关结论，黑茶发酵是一个由多菌种类协同作用的过程[11]。本研究选取分离菌株之一进行鉴定试验，后续也会依次对其他菌株进行鉴定分析。本研究模拟的发酵结果，口味并未完全达到青砖茶生产渥堆发酵后的效果，说明青砖茶发酵过程复杂，单一菌株发酵难以达到青砖茶的转化效果。但是，利用单个菌株进行青砖茶固态发酵的结果表明，发酵茶能够保持青砖茶的基本风味，汤色红黄，香气略甜，滋味醇和绵软，且发酵周期大大缩短，提高了生产效率。这些结果证实毛霉菌LC-2确实可以参与到青砖茶的发酵程序中，是青砖茶发酵生产的原生菌之一。在本研究的基础上，下一步工作将进一步探究人工固态发酵青砖茶与传统青砖茶内质成分差异，并从内质变化差异角度评价该菌株在发酵过程中的地位作用，为实现青砖茶清洁化生产奠定基础。