茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

刘平，任秋婧，康馨，张媛媛，林晓蓉，李斌，高雄，陈忠正

华南农业大学食品学院，广东 广州 510642

茶是世界三大无酒精饮料之一，含有茶多酚、生物碱、维生素、氨基酸、矿物质、茶多糖、有机酸等700多种药理活性物质及营养成分。咖啡碱是茶叶的主要生物碱，约占干物质含量的2%～4%，具提神醒脑、促消化、强心、解热镇痛等功效[1-2]。已有研究表明，植物体内咖啡碱生物合成的核心途径为：黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱，N-甲基转移酶（NMT）是催化其3步转甲基化反应合成咖啡碱的关键酶[3]。NMT基因的克隆始于Moisyadi等[4]对咖啡植物的报道，其克隆到的黄嘌呤核苷N-甲基转移酶基因具有催化咖啡碱合成第一步转甲基化反应的功能。茶叶中NMT基因的克隆最早由Kato等[5]在2000年报道，其克隆到的TCS1（AB031280）具有后两步转甲基化反应的功能。其后国内外研究者包括本课题组相继在茶叶、咖啡、可可等植物中克隆出多个具不同催化功能的NMT[6-8]，从基因角度证明 NMT基因具有家族性，咖啡碱/可可碱的合成是在多个NMT基因的作用下合成。

启动子是启动功能基因转录的重要部件，也是靶基因调控中转录调控因子结合并实施调控的重要元件，很多重要功能基因的启动子包括水稻、拟南芥等植物已进行了大量研究[9-11]。NMT作为咖啡碱合成的关键酶，已有报道多集中于NMT基因尤其cDNA的克隆，基因启动子的研究报道较少。2005年，Satyanarayana等[12]用PCR技术从咖啡植物中分离出NMT基因的启动子，并通过转基因技术在烟草中测定了克隆启动子的功能。茶树作为含咖啡碱植物，虽然在咖啡碱合成的NMT基因启动子研究方面有报道，但均停留在启动子序列分离阶段[7,13]，尚未见对其功能研究的报道。本课题组前期在克隆茶叶NMT基因的过程中，从英红9号茶树 cDNA文库筛选获得多个高度同源但具不同催化功能的NMT基因[8]，其中命名为NMT1的基因功能非常类似报道的TCS1，并发现仅NMT1基因会与同材料中克隆的其他NMT基因存在蛋白互作，基因表现非常特殊[14]。因此，本研究在克隆NMT系列基因基础上，利用 hiTAIL-PCR法从英红 9号茶树克隆YH-NMT1基因启动子，通过生物信息学分析其顺式作用元件，借助转基因技术研究该启动子的功能特性及环境胁迫对其功能的影响。研究的开展将为了解 NMT1基因启动子在植物发育过程中的表达模式提供实验依据，并为研究NMT基因转录调控及培育特定咖啡碱含量茶树提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

英红9号春季一芽二叶嫩梢，采于华南农业大学园艺学院实验教学基地，液氮冷冻后-80℃保存备用；烟草组培苗、大肠杆菌DH5α、农杆菌菌株 GV3101和植物双元表达载体pBI121由本实验室保存；T4DNA连接酶、LA Taq DNA聚合酶、XbaI、Hind III限制性内切酶、DNA marker购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物合成和DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

5804R高速离心机、Mastercyler pros基因扩增仪（德国Eppendorf公司），U410-86超低温冰箱（美国NBS公司），GHP-9080培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），MK20E恒温金属浴（杭州奥盛仪器有限公司），分析天平（Mettler Toledo公司），Milli-Q Integral 3纯水系统（美国 Milli-pore公司），XB-40制冰机（美国Grant公司），Bio-rad电泳仪、Gel doc XR+成像仪（美国 Bio-rad公司），OLYMPUS SZX16体视显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 NMT1基因启动子克隆与序列生物信息学分析

茶树基因组 DNA提取采用改良 CTAB法；启动子扩增按照文献[15]的 hiTAIL-PCR法，即以YH-NMT1基因5'端序列为基础，设计3条特异的巢式引物S1-0、S1-1和S1-2，结合4条LAD简并引物及AC1（表1）进行3轮巢式PCR扩增。首轮扩增以50 ng的茶叶基因组DNA为模板，以S1-0和LAD1—LAD4引物进行扩增；扩增产物稀释50倍后用S1-1和 AC1引物组合进行第 2轮扩增；再将第 2轮扩增产物稀释 10倍为模板用 S1-2和 AC1引物组合进行第3轮扩增，完成第1次扩增。第 1次扩增产物测序后，根据序列特点在其5'端再设计 3个特异性巢式 PCR引物 S2-0、S2-1、S2-2，结合4条LAD简并引物及AC1（表1）同上进行第2次扩增并测序。两次扩增产物PCR拼接验证克隆后连接至pMD18-T载体转化大肠肝菌DH5α并筛选出重组子。将得到的启动子用启动子在线分析软件 PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE）和 Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html）进行转录调控元件分析。

1.3.2 植物表达载体的构建

据生物信息学分析结果及 CAAT-box、TATA-box等顺式作用元件的线性分布，设计5'端引入Hind Ⅲ酶切位点的引物 pA-F、pB-F、pC-F、pD-F和 5'端引入XbaI酶切位点的引物p-R（表2），以鉴定含克隆启动子的重组子为模板，用引物组合 pA-F/p-R、pB-F/p-R、pC-F/p-R、pD-F/p-R分别扩增 5'端序列依次缺失的4个启动子。扩增引物经XbaI、Hind Ⅲ双酶切后，插入经同样酶切回收的pBI121载体以替换其CaMV35S启动子。连接产物转化大肠杆菌 DH5α并将筛选到的重组子进行PCR和测序鉴定，构建出4个5'端序列依次缺失的克隆启动子融合GUS基因的转基因载体pA、pB、pC、pD（图1）。

表1 hiTAIL-PCR扩增引物Table 1 Primers of hiTAIL-PCR

表2 载体构建PCR扩增引物Table 2 Primers of PCR in the vector construction

1.3.3 GUS瞬时表达分析

将构建好的4个重组载体和pBI121载体分别用热激法转化农杆菌GV3101菌株，参照吴英杰等[16]的方法进行GUS瞬时表达分析。即用农杆菌渗透法侵染烟草叶片，浸染过的外植体接种在共培养基（1/2 MS+120 µmol·L-1AS）上，28℃暗培养2～3 d后GUS染色，GUS组织化学染色参照Jefferson等[17]的方法，略有改动，染色结束后用75%的乙醇脱色处理至阴性对照为白色，用体视显微镜进行观察并照相。

1.3.4 烟草遗传转化与阳性植株筛选鉴定

将含有 pA和 pBI121的农杆菌 GV3101菌株，用叶盘转化法[18]分别对烟草转基因，经筛选培养（MS+200 mg·L-1Carb+75 mg·L-1Kan）获得抗性植株。对抗性植株采用CTAB法提取基因组 DNA为模板，以未转基因烟草为阴性对照，用引物 GUS-F：TCGGCTTTAACCTCTCTTTAG；GUS-R：ATTGTTTGCCTCCCTGCT对其 GUS基因扩增分析鉴定转基因植株。

图1 植物表达载体构建Fig. 1 Construction of plant expression vector

1.3.5 转基因烟草组织 GUS化学染色及 GUS基因表达量分析

参照 Jefferson等[17]的方法对鉴定的转基因烟草进行根、茎、叶的GUS组织化学染色，并用体视显微镜进行观察并照相。转基因烟草不同组织GUS基因表达采用实时荧光定量PCR技术，即以提取的各组织总RNA反转录cDNA为模板，用引物F：5'-CTCATTACGGCAAAGTG TGGGTCAA-3'和 R：5'-CAATAACATACGGC GTGACATCGG-3'扩增分析 GUS基因 mRNA表达量，以烟草β-actin基因为内参基因。

1.3.6 不同胁迫处理条件下转基因烟草叶片GUS基因的表达分析

为检测转基因植株在不同胁迫处理条件下GUS基因的表达情况，以转基因植株处理前的材料为对照（CK），对材料作如下处理：（1）正常条件下培养48 h（每天2 000 lux光照 16 h，8 h黑暗，25℃培养）；（2）黑暗及光照处理：将烟草苗置于黑暗条件下及2 000 Lux光照培养各48 h；（3）高低温处理：将烟草苗分别置于4℃和40℃培养48 h；（4）干旱处理：浇灌浓度为 30%的聚乙二醇（PEG6000）模拟干旱胁迫，培养48 h；（5）ABA 处理：100 µmol·L-1ABA 喷洒于烟草苗叶片上，培养48 h。将对照材料及处理后的材料分别取叶片，立即用液氮速冻，并提取总RNA，利用实时荧光定量PCR检测GUS基因的表达情况，方法同1.3.5。

2 结果与分析

2.1 茶叶DNA提取及NMT1基因启动子克隆

采用改良 CTAB法提取茶树叶片基因组DNA，以提取的 DNA 为模板进行hiTAIL-PCR。第1次hiTAIL-PCR利用巢式特异引物组合 LAD2引物成功扩增获得 500 bp片段（图1），测序分析后在其5'端再设计3个特异巢式引物进行第 2次 hiTAIL-PCR扩增，结果利用特异引物组合LAD3引物成功扩增获得5'端延伸的约500 bp新片段（图2），将两轮扩增的序列据重复区拼接后获得启动子序列。按拼接启动子序列5'端和3'端序列再设计特异引物从基因组中直接扩增靶启动子序列，结果得到的序列完全等同拼接的启动子序列，验证了克隆启动子的正确性，克隆的NMT1基因启动子序列长767 bp（图3）。

2.2 启动子序列分析及顺式作用元件预测

利用启动子在线预测数据库Plant Care和PLACE对克隆的NMT1基因启动子序列进行分析，结果表明（图4和表3），PNMT1序列中预测转录起始位点 TSS位于翻译起始位点上游63 bp的碱基A处。该启动子除具有真核生物启动子的基本结构 TATA-BOX 和CAAT-BOX等核心元件，还含有脱落酸响应元件ABRE，厌氧诱导响应元件 ARE，茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif，热应答元件HSE，乙烯应答元件ERE，胁迫相关应答元件TC-rich repeats，水杨酸响应元件TCA-element，以及多个光应答元件如AE-box、ATC-motif、Box-4、Box I、as-2-box 等。

图2 hiTAIL-PCR的第2轮和第3轮Fig. 2 Secondary and third amplification of hiTAIL-PCR

2.3 植物表达载体的构建

据克隆NMT1基因启动子元件分析结果，设计4对特异引物扩增5'端序列依次缺失的启动子各 767、452、352、210 bp，通过重组将各启动子片段插入到 pBI121载体，替换其GUS基因上游的CaMV35S启动子以构建植物转化载体。将构建的重组载体质粒进行 PCR鉴定，结果如图5所示，各重组质粒中扩增出预期大小的启动子片段大小与预期一致，经测序验证表明克隆启动子与 GUS融合的转基因载体构建成功，分别命名为pA、pB、pC、pD。

2.4 GUS瞬时表达分析

以含pBI121的GV3101菌株为阳性对照，空GV3101菌株为阴性对照CK，将pA、pB、pC、pD重组载体分别转入农杆菌 GV3101，利用渗透法浸染烟草叶片，经培养后进行GUS染色。结果表明，除CK未观察到染上蓝色外，其他载体转化叶片皆染上蓝色。4个重组载体载体转化的烟草叶片随插入启动子长度的增加染色加深，以含全长启动子的pA载体转化叶片染色明显深于其他 3个。阳性对照即pBI121转化叶片在所有转化叶片中染色最深（图6）。瞬时表达结果表明所克隆的NMT1基因启动子具驱动GUS基因表达的功能，且以全长启动子驱动能力最强。

图3 NMT1基因启动子的PCR扩增Fig. 3 Amplification of NMT1 promoter

图4 PNMT1的序列分析Fig. 4 Sequence analysis of PNMT1

表3 启动子调控区元件分析Table 3 Cis-acting regulatory element analysis of the promoter sequence

2.5 转基因烟草植株筛选鉴定

根据瞬时表达结果，选取含 NMT1基因全长启动子的pA载体进行农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，以pBI121载体为阳性对照，经筛选获得抗性植株。对各抗性植株提取叶片DNA，以非转基因烟草为阴性对照（CK），进行GUS基因的PCR检测，结果在选取的50株抗性植株中有37株扩增出预期GUS基因片段，而非转基因烟草未扩增出任何片段（图7），表明烟草转基因成功。

2.6 转基因烟草组织GUS化学染色及GUS基因表达量分析

选取鉴定的pA转基因烟草植株和非转基因烟草，分别对其根、茎、叶进行GUS组织化学染色，结果表明（图8），非转基因烟草各组织均无蓝色斑点，转基因烟草的根、茎、叶均检测到蓝色斑点，表明PNMT1启动子在烟草中驱动GUS基因表达无组织特异性。采用定量PCR对转基因烟草根、茎、叶中的GUS基因表达量进行分析（图9），结果发现转基因烟草不同组织中GUS基因表达量具显著差异，根部的表达量最少，茎部的表达量居中，约为根部的1.5倍，而叶片中的表达量最高，达到根部的3倍。

图5 重组质粒PCR鉴定Fig. 5 Identification of recombinant plasmid with PCR

2.7 不同胁迫处理条件下转基因烟草叶片GUS基因的表达分析

为探明克隆启动子的驱动能力与外界环境胁迫因子的关系，将 pA和 pBI121转基因烟草分别进行不同程度的光照、温度、干旱、激素等胁迫处理，并对处理前后的烟草叶片分别进行GUS基因表达量的分析，结果如图10。

由图10可知，pA转基因烟草正常生长48 h后GUS表达量均无显著差异，经黑暗、4℃低温处理48 h后，GUS表达量均降低约为处理前的40%；经光照、30%PEG、ABA处理48 h后，GUS表达量分别升高约为处理前的1.4、1.4、1.6倍；经40℃处理48 h后，GUS表达量较处理前无显著差异。而阳性对照pBI121转基因烟草在不同条件处理前后GUS表达量均无显著差异。由以上结果可知，克隆的 NMT1基因启动子驱动外源基因表达受外界环境因子的胁迫影响。

图6 GUS瞬时表达检测Fig. 6 Detection of GUS transient expression activity

图7 部分转基因烟草基PCR鉴定Fig. 7 The identification of partial transgenic tobacco with PCR

图8 转基因烟草组织GUS表达检测Fig. 8 Detection of GUS expression activity in transgenic tobacco tissues

图9 转基因烟草组织GUS基因表达量分析Fig. 9 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco tissues

图10 不同处理条件下转基因烟草GUS基因表达量分析Fig. 10 Analysis of GUS gene expression level in transgenic tobacco under different conditions

3 讨论

启动子在功能基因的表达与调控方面起着重要作用，启动子分离及相关研究一直是分子生物学研究的热点。在启动子分离方面，因所研究材料的基础背景不同呈现技术多样化。对全基因组已测序的生物，经设计特异引物即可扩增获得启动子，如 Yang等[19]对拟南芥pGC1基因启动子的克隆。对于没有基因组信息的生物，启动子分离技术主要包括两类：通过构建基因组文库再筛选出启动子，或是利用TAIL-PCR等侧翼序列扩增技术分离启动子。Tai等[13]通过构建基因组文库筛选克隆了茶树LAR、TCS、TS基因启动子。但基因组文库构建由于难度高、工作量大，限制了在启动子克隆上的应用。以 TAIL-PCR及其改良hiTAIL-PCR[15]为代表的靶基因侧翼序列分离技术，因具有简单快捷的优点，在启动子的分离上成功得到应用[20-21]。在本研究中，针对茶叶没有详细基因组信息可借鉴的客观情况，采用hiTAIL-PCR技术对茶树咖啡碱合成酶家族成员 NMT1基因的启动子进行克隆，成功获得靶基因的上游启动子序列，经NewPLACE、Plant CARE等[22-24]多个在线分析软件的分析预测，表明所分离的序列含有 TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件，确认克隆到靶基因的启动子，证明了所用技术的高效便捷性。

对分离到的启动子进行功能测定分析，是启动子研究的重要内容。将启动子连接报告基因构建表达载体，通过瞬时表达或转基因技术分析报告基因在宿主体内的表达特性，可以确定启动子驱动基因表达的特点[25]。有研究表明，启动子驱动基因的表达需要多个顺式调控元件，这些元件的种类和数量以及彼此之间的顺序、距离，都可能影响基因能否转录及转录的程度[26-27]。林文秋等[28]在研究菠萝SERK基因启动子时发现启动子越长其驱动报告基因表达的活性越强。本研究将克隆的启动子与GUS基因融合，在烟草叶片中进行瞬时表达，发现NMT1基因启动子越长驱动GUS基因表达的活性也越强，印证了前人对相关启动子活性研究的结果。另外，敬帆等[29]对蜡梅CpAGL6基因启动子功能特性研究发现，同一启动子在不同组织部位具有差异的驱动能力，曹华雯[30]和Li等[31]更是发现，启动子的功能还受到干旱、盐、ABA和低温等胁迫诱导的影响。本研究对克隆的启动子研究发现，其能驱动报告基因在转烟草的叶、茎、根中的表达，但以叶片中表达最高而根中表达最低，并发现其功能受外界环境胁迫因子包括光照时间、干旱、激素、温度的影响，表明本次所分离的启动子功能虽无组织特异性，但具有组织间差异的驱动能力，并且其驱动功能还受外界环境胁迫因子的影响，体现了克隆启动子功能表达的复杂性。有关 NMT1基因启动子如何精密驱动对基因的表达还在深入研究中。