液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立*

朱余军 丛 峰 肖 丽 饶 丹 伍妙梨 练月晓 黄碧洪 郭鹏举 张 钰 黄 韧 陈梅丽

(广东省实验动物监测所，广东省实验动物重点实验室，广州 510663)

马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是禽的重要疾病之一，属于疱疹病毒科，由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种高度接触性传染病，主要表现为各内脏器官、皮肤、外周神经、性腺及巩膜发生单个或多种组织器官的淋巴细胞增生和单核细胞浸润，形成肿瘤[1]。近年来，该病的广泛流行给养禽业带来了一定的经济损失。液相芯片技术又称为液相悬浮芯片技术或多重荧光免疫检测技术等，是一项新的快速高通量检测技术，它有机地整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果[2]。目前，在病毒检测方面该技术主要用于检测病毒核酸或抗体，而直接用于病毒抗原的检测研究较少[3]。本研究利用双抗夹心的液相芯片方法，系国内外首次建立马立克氏病病毒的液相芯片技术方法，可用于马立克氏病病毒的流行性调查，对马立克氏病的监测与防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1抗体及毒株：MDV的捕获抗体与检测抗体均由本实验室采用杂交瘤细胞技术制备的单克隆抗体；羊抗鼠IgG-PE购自于美国Thermo Scientific公司； MDV、新城疫病毒(NDV)、禽传染性贫血病病毒(CAV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽流感病毒(AIV)和禽白血病病毒(ALV)均由本实验室保存。

1.1.2主要试剂及仪器：19号羧基化荧光编码微球、抗体偶联微球试剂盒、鞘液、磁力架和luminex200仪器购自luminex公司；Streptavidin-R-Phycoerythrin(SA-PE)、生物素标记试剂盒、96孔酶标板、96孔过滤板购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1检测抗体生物素化：按照Thermo Scientific生物素标记试剂盒的操作说明书制备带有生物素的MDV的检测抗体，标记1 mg。

1.2.2偶联荧光编码微球的抗体量优化及偶联抗体效率的验证：按照luminex抗体偶联试剂盒的操作说明书制备MDV抗体偶联的荧光编码微球。由于偶联效果受抗体浓度的影响，本研究用1×106个19号荧光编码微球分别偶联 1 μg、2 μg、5 μg抗体，确定荧光编码微球的最佳偶联抗体量。再用检测二抗(羊抗鼠IgG-PE)与偶联的荧光编码微球直接反应进行偶联抗体效率验证。将偶联抗体的荧光编码微球用PBS-1%BSA稀释50个/μL，检测二抗稀释成7个浓度组，分别为4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.0625 μg/mL。每孔中加入50 μL荧光编码微球，再分别加入空白对照和稀释好的检测二抗，每组做3个复孔，在振荡混匀器上室温孵育30 min，清洗三遍，每孔加入100 μL PBS-1%BSA，用Luminex200仪器读取MFI值并进行数据分析。阴性对照的MFI值不得超过100，在检测二抗达到饱和的时候，MFI值至少达到10 000以上，才是最佳偶联抗体量。

1.2.3MDV液相芯片方法的检测抗体工作浓度优化:在确定最优偶联抗体量的基础上，优化检测抗体的工作浓度。SA-PE的浓度固定不变，用PBS-1%BSA将检测抗体稀释成4个浓度组，分别为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL。每个孔加入50 μL荧光编码微球和50 μL的阳性样品，同时设空白对照，将其放置在约800 r/min摇床上室温孵育30 min，清洗三遍，每孔中分别加入100 μL检测抗体，每组做3个复孔，在摇床上室温孵育30 min，清洗三遍，每孔中100μL浓度为4μg/mL SA-PE，在摇床上室温孵育30 min，清洗三遍，每孔中加入100 μl PBS-1%BSA，用Luminex200仪器读取MFI值，选取最高MFI值为最佳检测抗体的工作浓度。

1.2.4MDV液相芯片方法的SA-PE抗体工作浓度优化:在确定最优偶联抗体量和检测抗体工作浓度的基础上，优化SA-PE抗体的工作浓度。用PBS-1%BSA将SA-PE抗体稀释成4个浓度组，分别为1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL。操作步骤如1.2.3，选取最高MFI值为最优SA-PE抗体的工作浓度。

1.2.5MDV液相芯片方法的结果判定:根据Luminex公司推荐的判定标准，当每种荧光编码微球个数不少于35个，空白对照荧光强度不高于100时，表明试验成立，可进行结果判定。若样品孔MFI/空白对照MFI≥3，则结果判为阳性；若2≤样品孔MFI/空白对照MFI<3，则结果可疑，需重复实验；若样品孔MFI/空白对照MFI<2，则结果判定为阴性[3]。

1.2.6MDV液相芯片方法的特异性实验:利用本试验建立的液相芯片技术，对MDV、NDV、CAV、IBDV、IBV、ILTV、AIV、ALV和空白对照进行特异性试验。

1.2.7MDV液相芯片方法的灵敏度实验:将已知浓度为1.25×105pfu/mL的样品做10倍系列稀释，用已建立的液相芯片技术进行检测。

1.2.8MDV液相芯片方法的重复性实验:对同一个样品进行批内批间实验，每个样品做三个重复。

1.2.9MDV液相芯片方法对临床样品的检测:应用建立的液相芯片技术检测方法，对广东省一些鸡场送检的羽毛囊和组织共58份样本进行检测，并用PCR的方法进行验证。

2 结果

2.1 最佳偶联抗体量的确定

用检测二抗(羊抗鼠IgG-PE)与偶联抗体的荧光编码微球反应测量，结果表明，随着抗体量的增加，MFI值都有所增加，但在检测二抗达到饱和时，三个抗体量的MFI值都达到了10 000以上(图1)，说明这三个偶联抗体量都符合要求，综合各方面因素考虑，所以1×106个荧光编码微球的最佳偶联抗体量为2 μg。

图1 抗体偶联效率的验证结果

2.2 检测抗体工作浓度的确定

将检测抗体稀释成4个浓度组，分别为0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL。结果表明，随着检测浓度的升高，MFI值也升高。2 μg/mL与4 μg/mL检测抗体的MFI值显著高于0.5 μg/mL检测抗体的MFI值(P<0.05)，但1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL检测抗体两两之间的MFI值差异不显著，0.5 μg/mL与1 μg/mL检测抗体的MFI值差异也不显著，所以检测抗体的最佳工作浓度为2 μg/mL(图2)。

图2 液相芯片方法的检测抗体工作浓度

2.3 SA-PE抗体工作浓度的确定

将SA-PE抗体稀释成4个浓度组，分别为1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL。结果表明，随着浓度升高，MFI值也升高。4 μg/mL与8 μg/mL SA-PE抗体的MFI值极显著高于1 μg/mL SA-PE抗体的值(P<0.01)，8 μg/mL SA-PE抗体的MFI值显著高于2 μg/mL SA-PE抗体的值(P<0.05)，其他两两之间的SA-PE抗体的MFI值差异不显著，所以最佳SA-PE抗体工作浓度为4 μg/mL(图3)。

图3 液相芯片方法的SA-PE抗体工作浓度

2.4 特异性试验结果

选取MDV、NDV、CAV、IBDV、IBV、ILTV、AIV、ALV和空白对照，利用本试验建立的液相芯片方法进行检测，只有MDV为阳性，与其他病原无交叉反应，表明该检测方法有较好的特异性(图4)。

图4 液相芯片方法的特异性

2.5 灵敏度实验结果

对样品进行10倍系列的稀释，结果表明，本试验建立的液相芯片方法检测的灵敏度可达125 pfu/mL(图5)。

图5 液相芯片方法的灵敏度

2.6 重复性试验结果

对同一个样品进行批内批间实验，批内批间实验的变异系数都在5%以下，表明该方法有很好的可重复性(表1)。

表1 液相芯片方法批内和批间重复性试验

2.7 临床样品的检测

用已建立的液相芯片方法检测58份临床样品，检出18份阳性样本，阳性率为31%。对样品抽取核酸，用PCR的方法对样品进行检测，检出15份阳性样本，这两种检测方法的总符合率为94.8%。

3 讨论

目前，检测MDV的方法有病原分离与鉴定、ELISA、琼脂扩散试验及PCR等[4-6]。传统的检测方法费时费力，PCR检测方法虽然灵敏度高，但极易污染。液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一项高通量生物检测技术，具有通量大；操作简便、快捷；灵敏度、准确性高，重复性、灵活性好；用量少等特点。

本研究利用液相芯片技术平台，通过对偶联抗体量、检测抗体量、SA-PE抗体量进行优化，建立了一种液相芯片技术检测马立克氏病病毒的方法。通过实验得出，1×106个荧光编码微球的最佳偶联抗体量为2 μg，每个检测孔取约2 500个微球，相当于每个孔的捕获抗体量为5 ng，极大地节约了抗体和试剂的使用量。随着检测抗体量、SA-PE抗体量增加，MFI值也升高，检测抗体为2 μg/mL、4 μg/mL的MFI值显著高于0.5 μg/mL的MFI值(P<0.05)，但检测抗体为2 μg/mL与4 μg/mL之间的MFI值无显著差异，因此选择最佳检测抗体量为2 μg/mL。SA-PE抗体为4 μg/mL与8 μg/mL SA-PE抗体的MFI值极显著高于1 μg/mL SA-PE抗体的MFI值(P<0.01)，但SA-PE抗体为4 μg/mL与8 μg/mL之间的MFI值无显著差异，因此选择最佳SA-PE抗体量为4 μg/mL。

建立的液相芯片方法特异性好，对禽的其他病原没有交叉反应；灵敏度高，可以检测到125 pfu/mL；重复性好，批内、批间实验的变异系数都在3%以下。应用该方法对58份临床样品进行检测，阳性率为31%，与PCR检测方法比较符合率为94.8%。本试验建立的液相基因芯片检测马立克氏病的检测方法具有特异性强、灵敏度好、重复性好等优点，对大批量的样品检测具有优势。由于选用的单克隆抗体可以与三种血清型的MDV结合，因此可以用来筛选SPF鸡。