树鼩粪便中病毒三种浓缩方法的效果比较*

陈玲霞 尹博文 苗雨润 宋庆凯 李晓飞 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，树鼩种质资源中心，昆明 650118)

肠道食源性病毒传播途径为传染源-粪便-水体或食品-人，根据其致病类型可将其分为3种:引起胃肠炎的病毒，如杯状病毒、轮状病毒、星状病毒、腺病毒；肝炎病毒，包括甲肝病毒，戊肝病毒；引起其他疾病类型的病毒，如肠道病毒[1]。粪便污染水质样本，经水传播病毒导致人体感染的病例时有报道，已经引起人们的广泛关注[2-3]。对粪便中的病毒进行快速有效的检测，是阻断病原体传播的关键。高通量测序技术能够快速地鉴定出标本中存在的病毒,已形成了一门研究特定环境中病毒群落的新兴学科：病毒宏基因组学。但由于野生树鼩粪便中所含病毒丰度通常很低，而病毒宏基因组学需要获得足够的病毒核酸用于测序，为保证检测结果的质量，需要对树鼩粪便中的病毒进行预先富集浓缩。病毒的富集方法繁多，主要包括超滤法、吸附洗脱法、絮凝沉淀法等。病毒富集方法的选择与样品类型有关，国内外多数用于水体中病毒的浓缩富集，Rutjes等[4]使用膜吸附洗脱法浓缩水样病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀病毒结合超声分离以浓缩火鸡肠道组织的病毒，John等[6]采用铁离子絮凝的化学方法浓缩富集海洋病毒；国内寇晓霞等[7]采用三氯化铝和膜吸附法研究了不同水体的病毒浓缩回收率，徐露等[8]比较了钙离子法、牛肉汤洗膜法和载阳电荷滤料法对水体中病毒的浓缩效果。目前暂无研究报道针对粪便样品中的病毒浓缩方法。鉴于粪便样品的杂质含量多，超滤和膜吸附等方法容易堵塞，所以本文选择沉淀浓缩病毒的方法，即PEG沉淀结合超声分离法、铁离子絮凝的化学方法和GBviroFast病毒浓缩试剂盒等三种病毒浓缩方法。利用实时荧光定量PCR检测含有指示病毒TRV的模拟粪便上清，评价这三种病毒浓缩方法用于粪便中病毒浓缩的效果，为进行肠道病毒宏基因组学研究选择最佳的病毒富集浓缩方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生驯化树鼩，来源于医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。实验操作在医学生物学研究所树鼩种质资源中心实验设施进行[SYXK(滇)K2013-0001]。

1.2 实验设备和试剂

试剂：PBS(购自Thermo)、生理盐水(购自四川科伦药业)、PES膜过滤器(购自Millipore)、PEG-6000(购自国药集团化学试剂有限公司)、Fecl3·6H2O(购自BBI Life Sciences)、GBviroFast病毒浓缩试剂盒、QIAamp Viral RNA Mini Kit、TaKaRa One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、TRV为指示病毒(本实验室分离保存)。

仪器：CJJ78-1磁力加热搅拌器、JY92-IIN超声波细胞粉碎机、CT15RE低温离心机、CFX96TMReal-Time PCR Detection System扩增仪。

1.3 方法

1.3.1加标粪便上清的制备:采取野生驯化树鼩的新鲜粪便30份于40个EP管中，加PBS 1 mL/管，充分涡旋混匀，12 000 r/min离心30 min，取上清，经0.45、0.22 μm PES膜进行过滤，得滤液30 mL，分成3份，每份10 mL粪便上清加入TRV悬液140 μL。

1.3.2病毒浓缩方法

1.3.2.1 PEG-6000沉淀结合超声分离法:按W/V8%加PEG-6000至配置好的10 mL粪便上清，4 ℃搅拌过夜，12 000 r/min于4 ℃离心30 min，收集沉淀，4 ℃保存，上清经PEG-6000重复沉淀，将两次收集的沉淀悬浮于500 μL的冷生理盐水；对悬液进行超声5 min，超声5 s、停歇5 s、30个循环，超声后经12 000 r/min离心5 min，沉淀PEG颗粒，将上清移至新EP管。

1.3.2.2 铁离子絮凝法:取4.83 g Fecl3·6H2O加至1 L蒸馏水，配置成Fe3+浓度为1 g/L的溶液；取配置的溶液10 μL加入配置好的10 mL粪便上清，Fe3+终浓度为1 mg/L，充分混匀，4 ℃过夜；12 000 r/min于4 ℃离心30 min，收集沉淀，将沉淀悬浮于500 μL生理盐水中。

1.3.2.3 GBviroFast病毒浓缩试剂盒：取3.3 mL GBviro Precipitation Buffer与配置好的10 mL粪便上清混合(体积比1∶3)，上下颠倒混匀，4 ℃过夜，12 000 r/min离心30 min，收集沉淀，沉淀悬浮于500 μL生理盐水中。

1.3.3病毒RNA的提取:按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒的说明书进行操作。分为四组，取TRV病毒悬液、PEG沉淀结合超声分离法浓缩的粪便上清、铁离子絮凝法浓缩的粪便上清以及GBviroFast病毒浓缩试剂盒浓缩的粪便上清各140 μL进行病毒RNA的提取，每组提取三份病毒RNA。

1.3.4TaqMan 荧光定量RT-PCR方法检测病毒载量:采用前期本实验室建立的方法[9]，对TRV病毒悬液和稀释浓缩后的样品进行病毒载量的检测。

2 结果

2.1 TRV RNA标准品的标准曲线

将标准品梯度稀释，采用已建立的荧光定量RT-PCR的检测方法，利用5.13×106、5.13×105、5.13×104、5.13×103、5.13×102等浓度梯度，经过3次重复标准曲线相关系数R2均接近0.999，重复性良好(图1、图2)。

图1 TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线

图2 TaqMan荧光定量RT-PCR扩增曲线

2.2 TRV样本和稀释后浓缩样本的病毒载量

对TRV病毒悬液、粪便上清稀释后经PEG沉淀结合超声分离法浓缩的样品、铁离子絮凝法浓缩的样品以及GBviroFast病毒浓缩试剂盒浓缩的样品，即各组的三份病毒RNA为模板进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线(图3)，根据Ct值计算出样品的初始模板量(表1)。

图3 TaqMan荧光定量RT-PCR标准曲线

2.3 TRV病毒浓缩率的计算

根据TRV病毒悬液和粪便上清稀释后经浓缩方法的浓缩效率(表2)。经浓缩方法得到的样本量为500 μL，而提取RNA采用的体积量为140 μL，即浓缩得到的TRV病毒量=定量PCR测得的TRV病毒量×500÷140。

表1 三种浓缩方法的病毒拷贝数

表2 三种方法的浓缩效率

3 结论

粪便中病毒浓缩效果决定了病毒检测结果的准确性，因此，采用高效稳定的浓缩方法直接影响到病毒的检测结果。目前常用的病毒浓缩方法有超速离心、超滤浓缩、密度梯度离心、吸附洗脱等[10-14]，各方法浓缩病毒的原理和所用材料不同，故而使浓缩效果存在明显的差异。本文采取的PEG沉淀结合超声分离法、铁离子絮凝法以及GBviroFast病毒浓缩试剂盒三种方法的浓缩粪便上清中的病毒，不需要受限于样本的杂质含量。本实验中对指示病毒TRV经粪便上清稀释后浓缩的样本与TRV病毒悬液的病毒载量进行比较，通过荧光定量RT-PCR直接检测，计算各浓缩方法的回收率。

目前有铝离子絮凝、钙离子絮凝以及铁离子絮凝等方法用于水体中病毒的浓缩[6，15-16]。铁离子絮凝法是新型的病毒浓缩方法，铁离子形成的胶体能吸附和包裹水体中的病毒并形成絮凝，可通过滤膜截留或者直接离心沉淀，其优点是操作简单、效果稳定、快速。Hurwitz等[17]结果显示，三氯化铁浓缩得到的病毒/细菌的平均比约为2.2，优于切向流过滤TFF浓缩。该法一般用于海洋、饮用水等水体中病毒的浓缩，此次用于树鼩粪便上清，效果较佳，其病毒回收效率达49.57%。相比John等[6]浓缩富集海洋病毒采取的铁离子絮凝法中通过滤膜截留絮凝，本文直接离心沉淀的操作更简单方便。GBviroFast病毒浓缩试剂盒用于粪便上清的病毒回收效率为26.12%，可能由于粪便上清杂质较多，回收效率并不理想。PEG沉淀病毒[18-19]是经典的病毒沉淀方法，Colombet等[20]采用PEG浓缩纯化浮游生物病毒，Shah等[5]利用PEG沉淀浓缩肠道组织病毒，进行超声分离，获得病毒上清，经超高速离心而达到二次浓缩。由于粪便上清并不是组织细胞，超声破碎不能获得细胞内病毒，并且此次实验未进行二次浓缩，病毒浓缩效率仅为6.13%。从上述三种浓缩方法的病毒回收效率可以看出，浓缩方法还有待优化，可以尝试将两种方法或多种方法结合，相互补充，以达到更高的病毒浓缩效率，如何实现样本浓缩的高效稳定，需要进一步摸索探讨。