三白脂素-8抑制缺氧诱导因子-1α对肾癌细胞解偶联功能的影响

张永春，谷 江，董安涛，杨锦春

(1.武警贵州总队医院外二科，贵阳 550005；2.贵州医科大学附属医院泌尿外科，贵阳 550004)

缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)是恶性肿瘤细胞在抗乏氧环境下保持增殖的重要基因[1]，目前，通过抑制HIF-1α达到抑制恶性肿瘤生长的研究正成为研究热点[2]。而在HIF-1α的有效抑制剂中，三白脂素-8(manassantin A,Man A)是一种由三白草提纯而来植物制剂，对HIF-1α的特异性抑制作用很强[3]，而对正常细胞的毒性作用很小[4]。Man A可影响线粒体呼吸传递链，抑制细胞线粒体复合物的功能，并降低ATP的产量[3]。线粒体内膜上的线粒体解偶联蛋白2(uncoupling protein2,UCP2)，通过对线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP) 的稳定调节，使线粒体产能电势(mitochondrial membrane potential ΔΨm)达到动态平衡平衡，以此调节ATP的生成[5]，并与恶性肿瘤的增殖关系密切[6]。鉴于Man A和UCP2对细胞产能存在可能的相关性，因此本研究将Man A和UCP2一并引入研究，观察Man A对肾癌细胞的抑制作用并与UCP2的解偶联功能是否存在联系，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

肾癌细胞株(GRC-1)购于上海弗雷堡生物公司，Man A由武警后勤学院刘英福博士惠赠，RPMI1640购于Hyclone公司，MTT购于Sigma公司，总RNA提取试剂盒购于Fermentas公司，ELISA试剂盒购于R&D公司，G418购于Solarbio公司，DH5α菌种为贵州医科大学干细胞实验室提供相关的限制性内切酶、脂质体LipofectamineTM2000转染试剂、质粒抽提试剂盒均购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 25 cm2培养瓶中将肾癌细胞株置入，使用含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养液，培养瓶外部环境为5%CO2、37 ℃。换液频率为每2～3天1次，或消化传代每2～3天1次，当细胞培养生长为对数期时进行后继试验。

1.2.2质粒构建及其鉴定

1.2.2.1HIF-1α/pcDNA3.0载体的构建 氯化钙法制备DH5α大肠杆菌感受态细胞，保存于-70 ℃低温冰箱。HIF-1α基因的CDS区序列(NM-001530)于NCBI获得，引物设计使用Primer5.0软件。上游5′-AAA AAT CTA GAA TGG AGG GCG CCG GCG GCG CGA ACG-3′，下游为5′-CCC CCG GAT CCT CAG TTA ACT TGA TCC AAA GCT CTG-3′，引物合成自大连宝生物公司。 PCR扩增及反应条件：预变性94 ℃、3 min，变性94 ℃、30 s，退火53 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，全程共35个循环。载体及目的基因分别经BamH1和HindⅢ进行双酶切，将载体与酶切基因按3∶1的摩尔比进行过夜连接，外界环境为16 ℃，设立质粒阳性和阴性对照。取4 μL将连接产物接种于100 μL的DH5α感受态细胞中。挑取单菌落扩增并抽提质粒，使用限制性内切酶BglⅡ进行单酶切鉴定，将重组质粒命名为HIF-1α/pcDNA3.0。

1.2.2.2鉴定重组质粒序列 使用3730XL型DNA自动测序仪测序，由大连宝生物公司进行。

1.2.3质粒转染 肾癌(GRC-1)细胞的转染由脂质体介导：细胞株于25 cm2培养瓶中培养，汇合度达到90%后使用胰酶消化，于24孔培养板接种，加入无双抗RPMI1640及10%胎牛血清，48 h后细胞密度约80%～90%。A液(于147 μL无双抗、无血清的RPMI1640培养液中加入3 μL质粒，静置5 min)、B液(于144 μL无双抗、无血清的RPMI1640培养液中加入6 μL LipofectamineTM2000，静置5 min)，C液(A液和B液混合为C液)。将C液移入培养板，密度为每孔100 μL，加入无双抗、无血清的RPMI1640培养液，密度为每孔400 μL。培养6 h后换含10%胎牛双抗、血清的RPMI1640培养液，24 h后按1∶10给予传代，24 h后加入含G418的维持液进行筛选，每3～5天换液1次。

1.2.4细胞分组与干预 对HIF-1α/pcDNA3.0、空载体质粒使用脂质体LipofectamineTM2000转染，对照组为肾癌(GRC-1)细胞，转染效率提示转染成功后，构建高表达HIF-1α基因的转染组肾癌细胞，未行基因干预的GRC-1细胞定义为非转染组，实验组及对照组分别使用密度为0、0.1、0.2、0.4 μmol/L的Man A溶液进行干预并依次命名为对照组及低、中、高剂量组。

1.2.5检测实验设计指标

1.2.5.1半定量PCR检测GRC-1细胞内UCP2、HIF-1α的基因表达 待25 cm2培养瓶细胞汇合度达到90%后行分组处理，提取GRC-1细胞总RNA，检测RNA的完整性与浓度，逆转录及合成cDNA。引物序列如下所示：β-actin(正向5′-CCC TGG ACT TCG AGC AAG AGA T-3′，反向5′-GTT TTC TGC GCA AGT TAG G- 3′)，UCP2(正向5′-GAC CTA TGA CCT CAT CAA GG-3′，反向5-GTT TTC TGC GCA AGT TAG G-3′)，HIF-1α(正向5′-TCC AGC AGA CTC AAA TAC AAG AAC-3′，反向5′-GTA TGT GGG TAG GAG ATG GAG ATG-3′)，反应条件为：预变性94 ℃、3 min，变性94 ℃ 、30 s，退火53 ℃ 、30 s，延伸72 ℃、 1 min，进行35个循环，终止反应条件为72 ℃、 5min；于2%琼脂糖凝胶中对PCR产物进行电泳，经Image J软件行条带分析，将检测基因与β-actin的光密度比值代表所检测基因的半定量表达。

1.2.5.2ELISA检测UCP2、HIF-1α的蛋白表达 使用细胞裂解液及PMSF裂解细胞，离心半径8.5 cm、12 000 r/min对细胞离心5 min，取上清液按每孔50 μL滴加，分别将相应孔板设空白孔、标准孔及待测样品孔，上述检测严格按照试剂盒说明书的提示操作。

1.2.5.3细胞增殖活性的检测 将细胞接种于96孔板，密度约104个/孔，均设6个复孔，分组处理24 h后吸弃原有培养基，加5 μg/L的MTT 20 μL及无血清培养基80 μL，孵育4 h(环境为37 ℃)后吸弃培养孔内液体，加入二甲亚砜150 μL后低速震荡(震荡时间为10 min)，酶标仪(490 nm)检测其吸光度(A)值。

1.2.5.4细胞内ATP水平的检测 分组处理细胞并消化离心后，加入520 μL无血清培养基，再加入520 μL 2%的三氯醋酸后冰浴、离心，时间为5 min。取300 μL上清液、300 μL NADH液、10 μL磷酸甘油醛脱氢酶一磷酸甘油激酶进行混合，检测NADH下降的A值，根据标准曲线计算ATP的值。

1.2.5.5线粒体提取及鉴定 实验步骤均于冰面上进行，25 cm2细胞培养瓶中培养细胞汇合度约80%后分组处理，消化离心，裂解，离心半径9.3 cm、4 000 r/min条件下离心10 min。取上清液，离心半径8.9 cm、 10 000 r/min条件下离心15 min后弃上清液，收集所得沉淀。将沉淀均匀涂抹于载玻片，加詹纳斯绿B染液(0.02%)，浸染10 min，用10×40倍的高倍镜观察，重复3次。

1.2.5.6mPTP开放程度的检测 使用上述方法制备线粒体悬液。将3 mL测定介质P分别加入分组后的线粒体悬液，摇匀。对照组加入的测定介质P为4 mL，分光光度计(752N型)于540 nm测定A值，mPTP开放程度与A值呈负相关。

1.2.5.7ΔΨm的检测 制备及分组线粒体悬液同上。将6.6 μL Rh123加入线粒体悬液中，避光孵育30 min(37 ℃水浴箱)，荧光分光光度计检测其(激发光：480 nm，发射光：525 nm)荧光强度，ΔΨm的大小与荧光强度呈负相关。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 对HIF-1α重组质粒的鉴定结果

3730XLDNA测序仪对送检标本进行测序后符合Genebank上的序列，见图1。

图1 HIF-α/pcDNA3.0质粒的部分测序结果

2.2 评价GRC-1细胞质粒转染的效率

转染组、非转染组的HIF-1α半定量表达分别为0.71±0.09、0.42±0.03。转染组较之非转染组显著增高(P<0.01)，证明高表达HIF-1α的肾癌细胞已成功构建，见图2。

2.3 各实验指标的检测结果

2.3.1HIF-1α、UCP2的基因表达结果 转染组较之非转染组，HIF-1α基因的表达量显著增高(P<0.05)。转染组细胞UCP2基因的表达量虽低于非转染组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图2 HIF-1α的PCR电泳图

图3 HIF-1α、UCP2基因的表达结果

2.3.2Man A干预各组细胞后检测HIF-1α和UCP2基因表达 非转染组和转染组细胞较之对照组，HIF-1α基因在各组细胞的表达随着Man A剂量的增加而下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。而UCP2基因的亦随着Man A剂量的增加而逐渐下降，非转染组可在高剂量组出现显著下降(P<0.05)。转染组在中、高剂量组均出现了显著下降(P<0.05)，见表1和图4。

A：非转染组HIF-1α；B：转染组HIF-1α；C：非转染组UCP2；D：转染组UCP2

表1 Man A对各组肾癌细胞内HIF-1α、UCP2基因表达的影响

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低剂量比较；c：P<0.05，与中剂量组比较

表2 Man A对各组肾癌细胞内HIF-1α、UCP2蛋白表达的影响

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低剂量比较；c：P<0.05，与中剂量组比较

2.3.3Man A干预细胞后HIF-1α、UCP2的蛋白表达水平 非转染组和转染组细胞较之对照组，HIF-1α的蛋白表达量随Man A剂量的增加而下降，非转染组除低剂量组外，其余各组HIF-1α蛋白表达量差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比，非转染组和转染组细胞各剂量组UCP2蛋白的表达量，随着Man A剂量的增加而逐渐下降，但均仅在高剂量组出现明显差异(P<0.05)，见表2。

2.3.4Man A干预各组细胞后检测细胞内ATP水平 非转染组和转染组细胞较之对照组，细胞内ATP水平随着Man A剂量的增加而下降，在高剂量组出现明显差异(P<0.05)，见表3。

表3 Man A对各组细胞内ATP水平的影响

a：P<0.05，与对照组比较

2.3.5Man A干预各组细胞后检测细胞增殖活性 各实验组较之对照组，其A值均增高，且随着Man A剂量的增加而逐渐下降，两组细胞在中、高剂量组均出现显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 Man A对各组肾癌细胞增殖活性的影响

a：P<0.05，与对照组比较

2.3.6线粒体在镜下的形态学鉴定 根据染色(詹纳斯绿B)结果显示：细胞中提取的线粒体在外形上呈圆形、椭圆形和杆状，见图5。

2.3.7Man A干预各组细胞后mPTP的变化情况 与各自的对照组相比，两组细胞随着Man A给药浓度的逐渐增加吸光度逐渐降低。非转染组的中、高剂量组，转染组3个实验组差异均有统计学意义(P<0.05)。A值在各转染组中显著高于相同剂量非转染组(P<0.05)。

图5 线粒体的镜下染色(×400)

组别n 非转染组A值转染组A值对照组60.097±0.0240.253±0.029 低剂量组60.092±0.0160.194±0.033a中剂量组60.075±0.028ab 0.141±0.046ab高剂量组60.063±0.031ab 0.093±0.027abc

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低剂量比较；c：P<0.05，与中剂量组比较

2.3.8ΔΨm在Man A干预细胞后的变化 各实验组随着Man A给药浓度的增加，其荧光强度亦增强，与对照组比较，中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 细胞行Man A干预后ΔΨm的变化

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与低剂量比较；c：P<0.05，与中剂量组比较

3 讨 论

恶性肿瘤的能量代谢、细胞增殖、凋亡等在很大程度上依赖HIF-1α来维持[7]。机体低氧状态时，HIF-1α生成增加，以维持细胞的氧自稳和能量代谢平衡[8]。HIF-1α是公认的肿瘤适应低氧环境重要调节剂[9]，缺氧环境可促使HIF-1α在细胞中稳定表达，促进肿瘤发生转移等恶性倾向，产生放化疗抗药性[10]。目前，国内外针对有效抑制HIF-1α的功能，达到抑制肿瘤生长的研究逐渐成为热点[2]，但尚未针对肾癌细胞进行过相关研究。因此，本实验将HIF-1α的植物抑制剂Man A引入了肾癌细胞的研究中。

Man A于1983年首次被报道从三白草中提取出的一种双新木脂体，在亚洲国家作为传统中药运用于治疗水肿、黄疸、淋病等多种疾病[12]。多项研究均证实Man A对HIF-1α有强烈的抑制作用[3]，有研究报道发现Man A可影响线粒体呼吸传递链(ETC)，抑制细胞线粒体复合物的功能，并降低ATP产量[5]。线粒体解偶联蛋白2(UCP2)是线粒体内膜上的一种质子转运蛋白，介导跨线粒体内膜的质子流，使呼吸链与ATP产生解偶联[13]，是线粒体呼吸功能、ATP生成的关键调节蛋白。基于Man A、UCP2均对线粒体内外膜电势、ATP生成等有生理作用具有功能上的交叉点，故本实验将UCP2作为Man A干预肾癌细胞后的观察指标，判断UCP2是否在Man A干预肾癌细胞后出现改变，以资推断Man A抑制HIF-1α后，UCP2是否参与其作用机制。

实验结果提示，成功构建高表达HIF-1α的肾癌细胞株中UCP2的基因表达量出现了上升趋势，但未出现显著差异，提示HIF-1α的表达增高和UCP2无明显关系；当实验中给予Man A进行干预后，HIF-1α的基因及蛋白表达量均出现显著下降，符合Man A作为HIF-1α阻断剂的理论前提。UCP2的基因及蛋白表达量出现下降趋势，特别是在高剂量Man A干预后出现了显著下降，这可能与Man A影响了线粒体膜电势，并降低ATP的生成，负反馈于UCP2造成，亦可能是Man A直接作用于UCP2，降低其基因及蛋白的表达。但此项结果尚需对UCP2的基因进行调控并完善其他指标后才能明确判定。在检测细胞ATP产量时发现，随着Man A干预剂量的不断增加，两组细胞的ATP水平逐渐减少，在高剂量组可出现显著下降，符合以往研究对Man A生理功能的描述。为了探讨Man A对肾癌细胞ATP产量影响的具体机制，本研究检测了线粒体解偶联功能相关指标mPTP及ΔΨm。实验结果提示，Man A可提高mPTP开放程度，并导致ΔΨm的降低，并因此降低了线粒体内外膜电势，造成ATP产量的减少。这一现象与UCP2表达降低的结果是符合的。线粒体解偶联功能的改变可能是Man A抑制了UCP2的表达造成，亦有可能是Man A直接作用于线粒体后导致，且并不能判断是否因Man A抑制了HIF-1α后带来的产能影响。需进一步实验明确。

HIF-1α有利于肾癌细胞在低氧环境下的生存[14]，而找到抑制HIF-1α的药物对于肿瘤的生长势必能产生负向调节的作用。Man A属三白草属提取的植物制剂，目前有较多的萃取及合成方法[15]，长期运用于其他疾病的治疗，未见不良反应的报道。结合以往研究以及本实验的结果证实，Man A可有效抑制HIF-1α及肾癌细胞的生长和产能，其具体作用机制与线粒体解偶联功能关系密切，但其具体作用与UCP2的关系尚需进一步研究证实，这也为本课题组下一步的实验提出了方向和要求。